复方枇杷叶膏微生物限度检查法的建立与结果分析

纪开明,朱月辉,高婷婷,方 凌

(1.铜陵市食品药品检验中心,安徽 铜陵 244061; 2.安徽省牡丹产业工程技术研究中心,安徽 铜陵 244061)

复方枇杷叶膏处方由8味中药组成(枇杷叶100g、车前草75g、百部15g、苦杏仁15g、桔梗15g、麻黄15g、浙贝母15g、甘草15g),用于风热咳嗽,咽喉干燥,咯痰不爽[1]。药品当中的微生物对于产品质量和用药安全有着很大的影响,对于药品生产中,做好微生物的检验是确保药品无菌化的主要方式,微生物限度检查是所有中成药的必检项目,对于复方枇杷叶膏应进行需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数和控制菌(大肠埃希菌、沙门菌)检查方法适用性试验[2-3]。

微生物限度检查指检查非规定灭菌制剂和原辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包含细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌数检查[4-7]。常用抑菌方法有四种,即稀释法、薄膜法、中和法、离心法,或几种方法联合使用[8],离心法成本相对较低而且方法简单、有效可操作。

此试验按照中国药典通用技术要求生物检查法,对 12个批次复方枇杷叶膏进行试验及验证,并对验证结果进行数据分析,为复方枇杷叶膏的微生物限度方法学验证奠定了基础,加强了对复方枇杷叶膏产品的质量把控。

1 材料与方法

1.1 仪器

S25 圆周震荡器(德国艾卡集团); AB135-S电子天平(瑞士梅特勒公司); GHP-9162型恒温培养箱(扬州慧科电子有限公司); 3870ELVC 型立式全自动高压蒸汽灭菌器(Tuttnauer公司); SPX-150型生化培养箱(扬州慧科电子有限公司)。

1.2 实验菌株

大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、黑曲霉[CMCC(F)98 003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50 094],以上菌种由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 培养基、试剂

沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:200511)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号: 200821)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号: 200630)、胰酪大豆胨液体培养基(批号:200525)、麦康凯琼脂培养基(批号: 200217)、麦康凯液体培养基(批号: 201015)、RV沙门增菌液体培养基(批号:201118)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(批号:201009),pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号: 201225)(以上培养基均由北京三药科技开发公司提供)。

1.4 实验样品

复方枇杷叶膏(广东新功药业有限公司、贵州百灵企业集团制药股份有限公司、广西梧州三箭制药有限公司三个公司各4批次)。

1.5 实验方法

1.5.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数试验验证

1.5.1.1 菌液的制备

菌液A:吸取30℃培养24h的金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨液体培养物1mL,加0.9%的无菌氯化钠溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌悬液,作为活菌计数用。

菌液B:吸取30℃培养24h的铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养物1mL,加0.9%的无菌氯化钠溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌悬液,作为活菌计数用。

菌液C:吸取30℃培养24h的枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养物1mL,加0.9%的无菌氯化钠溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌悬液,作为活菌计数用。

菌液D:吸取25℃培养36h的白色念珠菌培养物1mL,加0.9%的无菌氯化钠溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌悬液,作为活菌计数用。

菌液E:吸取25℃培养168h的黑曲霉培养物适量,加5mL含0.05%聚山梨脂80的0.9%的无菌氯化钠溶液,洗霉菌孢子,球形吸管取出菌液,用标准比浊管比浊后,稀释为不多于100cfu/0.01mL 的菌悬液,作为活菌计数用。

1.5.1.2 样液的制备

称取样品约10 g,加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10的溶液。

1.5.1.3 需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

试验组:分别取上述五种菌液A、B、C、D、E各0.01mL与1mL供试液混合后加入培养基,按离心法测定其菌数。

供试品对照组:取供试液1mL与0.01mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液混合后加入培养基,按离心法测定其菌数。

菌液对照组:分别取上述五种菌液A、B、C、D、E各0.01mL与1mL灭菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液混合后加入培养基,按离心法测定其菌数。

结果计算:回收率=(试验组的平均菌数-供试品对照组平均菌数)/菌液对照组平均菌数 ×100%。

1.5.2 控制菌(大肠埃希菌、沙门菌)方法验证

1.5.2.1 菌液制备

取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物适量,各接种至5mL胰酪大豆胨液体培养基中,置恒定36℃培养箱中培养24h,取培养物1mL加0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌不多于100fu/mL的菌悬液,其菌数在做对照试验的同时用胰酪大豆胨琼脂培养基注皿或平板涂布,经培养后计数确定。

1.5.2.2 样液的制备

取样品约10 g,加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液适量制成1∶10的溶液。

沙门菌检查的供试液制备:取供试样品10g,直接接种于胰酪大豆胨液体培养基200mL中,混匀,培养24小时。

1.5.2.3 验证方法

取适量供试液及不多于100cfu试验菌加入到增菌培养基中,按照相应控制菌检查法进行检查。

1.5.2.4 结果

假如试验组检出试验菌,那么按照此供试液制备法和控制菌检查法进行该供试品的控制菌检查;假如试验组未检出试验菌,那么需按照需氧菌、霉菌和酵母菌计数具抑菌活性的供试品项下操作,以消除供试品的抑菌活性。

1.6 结果与分析

1.6.1 供试液为1∶10 时

复方枇杷叶膏对五种菌种的回收比值都在0.5～2.0之间, 全部没有明显的抑菌现象, 结果见下表 1。因此,此试验方法进行方法适用性试验可行。

表1 需氧菌总数、霉菌及酵母菌的回收比值(n=3)

1.6.2 供试液浓度为 1∶10 时控制菌的结果

表2 控制菌(大肠埃希菌、沙门菌)结果

2 结论与讨论

复方枇杷叶膏微生物限度是检验中药制剂是否安全用药的重要指标之一,复方枇杷叶膏的微生物限度符合《中国药典》(2020 年版四部)通用技术要求是基本要求,本试验采用了离心法对其结果各规定菌株的回收率均可达到《中国药典》(2020 年版四部)要求[1,9],说明此方法对复方枇杷叶膏的质量控制简单、有效、可行。

本试验按《中国药典》(2020 年版四部)生物检查法进行3次独立适用性试验,为检验复方枇杷叶膏的微生物限度方法学验证奠定了基础[1,10-12],加强了对复方枇杷叶膏产品质量的把控。