叶酸对孕鼠子代生长发育及孕鼠血清叶酸、Hcy水平的影响研究*

吴淑娴，宣佳利

(安徽卫生健康职业学院，安徽 池州 247099)

中国每年患有神经管畸形的新生儿有8万～10万，是引起婴儿死亡、死胎的重要因素[1]。研究显示，多种出生缺陷的神经管畸形同女性在怀孕早期机体缺乏叶酸存在一定的相关性[2-4]。叶酸为水溶性的一种B族维生素，机体自身不能合成，只能经膳食摄入，在机体内通过四氢叶酸使其生理功能得到有效发挥，在细胞的增殖分裂、合成核苷酸与氨基酸的过程中发挥重要作用，为人体生长发育必要的一种微量营养素[5-6]。在妊娠期，对叶酸需求量增加，尤其在妊娠早期，为了满足胎儿快速生长发育的需求，需提供充足的叶酸，满足细胞复制要求，进而影响母体组织、胎盘、胎儿的生长，同时在合成蛋白质、RNA、DNA期间起到关键的作用[7-8]。所以，妊娠期母体的叶酸状况一方面同自身的健康状况有关，另一方面缺乏叶酸也会对胎儿的正常发育产生影响，造成诸多不良结局，如神经嵴疾病、神经管畸形、低出生体重、胎儿发育迟缓等[9]。高同型半胱氨酸血症与神经管畸形关系密切，神经管畸形新生儿的母亲血清内同型半胱氨酸(Hcy)水平显著提高，Hcy的蓄积是造成神经管畸形的一个危险因素[10-11]。基于此，本研究对30只SD雌性大鼠进行研究，探讨叶酸对孕鼠子代生长发育及孕鼠血清叶酸、Hcy水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证批号为SCXK(京)2012-0001，体重 22～34 g，周龄6～8周，在我院动物中心的饲养室喂养，饲养室相对湿度45 %～55 %，温度24～26 ℃，饮食、水分补充均自由。

1.2方法 (1)构建动物模型：将30只SD雌性大鼠依据随机数字表法分为缺乏叶酸组与正常叶酸组，各15只。缺乏叶酸组使用缺乏叶酸饲料饲养，正常叶酸组使用正常叶酸饲料饲养，14 d后，同成年SD正常雄鼠按照1：1的比例合笼交配。每天下午6：00合笼，第二天上午8：00将雌鼠阴道分泌物抽取至载玻片中，于显微镜下发现精子当天记为孕0 d，之后于普通饲养笼饲养，直到取材。(2)收集标本：受孕3周后，按3.33 mL/kg的10 %水合氯醛腹腔注射实施麻醉，剖腹后取胎，两组分别取40只胎鼠(雌雄各半)，测量体重、头尾长度。(3)生长发育检测：对40只胎鼠的毛发生长、门齿萌出、仔鼠耳廓分离、双眼睁开等生长发育相关指标进行观察，记录达标天数。(4)叶酸检测：剖腹取胎后，断头处死孕鼠，将0.10 g左右的皮层额叶与双侧海马取出，然后将0.10 g左右的肝脏左叶取出，距离幽门1 cm左右取小肠5 cm，顺着肠系膜裁剪，将表皮的黏膜组织(0.05～0.10 g)轻轻刮取。吸去小肠黏膜上皮、海马、肝脏、皮层标本的血迹置入匀浆器(包含醋酸0.2 mol/L)内，制成1.5 mL匀浆，于4 ℃条件下，3 000 r/min的转速离心15 min，选取上清液。将事先准备好的试管内置入质控、校正或检测样本200 μL，各个试管内均置入工作液1 000 μL，混匀。全部试管放置沸腾水浴中15～20 min，之后室温水浴箱中放置5 min冷却。取经过处理的样本380 μL至样本杯中，使用电化学发光分析仪对其叶酸水平进行检测。(5)Hcy检测：分娩前，眼眦取2 mL孕鼠血于毛细管中，分娩后采集4 mL股动脉血于EDTA抗凝管内，于4 ℃条件下，2 500 rpm离心10 min，分离血清，置入EP管，保存于-80 ℃的环境中待检，使用全自动生化分析仪检测Hcy水平。

2 结果

2.1两组孕鼠子代体重、头尾长及相关生长发育指标比较 正常叶酸组孕鼠子代体重、头尾长度明显高于缺乏叶酸组(P<0.05)；毛发生长、门齿萌出、耳廓分离、双眼睁开与缺乏叶酸组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2两组孕鼠不同时间点血清叶酸水平比较 怀孕7 d前，两组叶酸水平无明显差异(P>0.05)；合笼交配期、妊娠第10 天、分娩后，正常叶酸组叶酸水平明显高于缺乏叶酸组(P<0.05)。见表2。

表1 两组孕鼠子代体重、头尾长及相关生长发育指标比较

表2 两组孕鼠不同时间点血清叶酸水平比较

2.3两组孕鼠不同时间点血清Hcy水平比较 怀孕7 d前，两组血清Hcy水平无明显差异(P>0.05)；妊娠第10天、分娩后，正常叶酸组血清Hcy水平明显低于缺乏叶酸组(P<0.05)。见表3。

表3 两组孕鼠不同时间点血清Hcy水平比较

3 讨论

四氢叶酸为叶酸活性形式，属于人体生化反应内如次甲基、亚甲基、甲基等一碳单位的传递体，能够对受基因调控代谢合成DNA 过程进行干预[12]。人体发育、组织生长以及细胞增殖与代谢合成DNA息息相关[13]。20世纪90年代以来，叶酸被广泛应用于神经管畸形等出生缺陷疾病的预防中，我国目前围妊娠期补充叶酸已经在基层普及[14]。相关研究显示，叶酸不足能够对合成核苷酸产生影响，可以对细胞的增殖、分裂、成熟产生抑制作用[15]。妊娠期，胎儿及孕体生长、发育旺盛，对叶酸的需求量增加，若在怀孕期间缺乏叶酸，就会导致一碳单位转移出现障碍，降低核酸合成，进而对细胞周期产生影响[16]。依据相关报道，整个妊娠期每天口服0.4 mg叶酸增补剂，能够避免41 %～85 % 新生儿神经管畸形的发生[17]。也有文献显示，于孕早期口服叶酸会使发生唇、腭裂、先天性心脏病等出生缺陷的风险降低[18]。所以，叶酸属于胚胎器官发育期间不可或缺的营养素。

在孕期，机体的营养素被优先用于胎儿生长发育的维持，若出现营养不良就会造成胎儿发育迟缓，发生新生儿低体重、宫内生长受限等状况[19]。体重能够对子代新生鼠的发育状况进行客观的反映，一般评价子代新生鼠生长发育的相关指标还包括毛发生长、门齿萌出、仔鼠耳廓分离、双眼睁开，上述几项指标均为生长发育期间的敏感点。本次研究选择饲料干预的手段，按照饲料内是否含有叶酸对雌鼠实施叶酸干预，结果显示，饲以缺乏叶酸饲料的子代新生鼠的毛发生长、门齿萌出、仔鼠耳廓分离、双眼睁开的达标天数都长于饲以正常叶酸含量饲料的子代新生鼠，然而差异没有统计学意义。首先，这可能是由于叶酸属于微量营养素的一种，机体需要叶酸的数量比较低，同时叶酸的生理功能主要是参与胎儿神经管闭合，避免出现神经管畸形，所以，叶酸影响子代鼠的有关生理发育指标可能不明显[20]。其次，所有雌鼠都喂养繁殖饲料，子代鼠可以经由母乳得到充足的营养素，补充了叶酸，跟随日龄的不断增加子代鼠毛发生长、门齿萌出、仔鼠耳廓分离、双眼睁开的达标天数的差异缩小[21]。

同型半胱氨酸(Hcy)属于人体必要氨基酸之蛋氨酸脱甲基后出现的含硫氨基酸之一，为代谢半胱氨酸与蛋氨酸的中间产物[22]。腺苷转移酶在催化过程中，蛋氨酸会产生S-腺苷蛋氨酸，同时，转甲基酶在催化过程中，S-腺苷蛋氨酸会转移分子内的甲基，自身会演变为S-腺苷同型半胱氨酸，于S-腺苷同型半胱氨酸裂解酶发挥作用的过程中将腺苷脱去，最终形成Hcy[23]。有动物实验显示，通过Hcy对鸡胚进行诱导，Hcy能够导致神经管畸形及心脏畸形[24]。通过进一步研究显示，Hcy造成出生缺陷疾病的原理为其能够发挥基因毒性与细胞毒性的作用，在代谢期间氧化巯基，使氧自由基大量出现，进而导致细胞死亡[25]。代谢Hcy的一个途径是再甲基化成蛋氨酸，再甲基化需要甲基，而甲基主要由叶酸提供，所以叶酸是对血清Hcy水平产生影响的重要因素[26]。此外，代谢Hcy的另一个途径为胱硫醚- β -合成酶发挥催化作用，丝氨酸同Hcy缩合为胱硫醚。如果上述途径均出现代谢障碍，就会造成Hcy在体内蓄积，积累至一定水平时就会出现高Hcy血症。近几年相关文献显示，在妊娠期，孕体蛋氨酸水平轻度减少或血清Hcy水平轻度提升能够对闭合神经管产生影响[27]。本次研究选择全自动生化分析仪检测了孕鼠血清中Hcy与叶酸的含量，初步探讨它们之间的关系，发现随着孕鼠血清叶酸水平的增加，饲以缺乏叶酸饲料的孕鼠的Hcy水平较正常叶酸含量饲料的孕鼠高，也就是说血清中叶酸与Hcy水平的关系表现为负相关关系。

综上所述，叶酸的缺乏会对孕鼠子代体重及头尾长度产生影响，通过叶酸干预可以使孕鼠血清叶酸水平升高，Hcy水平降低，进而使神经管畸形的相关危险因素弱化。