响应面法优化小茴香籽提取工艺及抗氧化活性研究

陈 强，豆海港，崔孟姣，杨 改，郝艳丽

（周口职业技术学院，河南 周口 466001）

香辛料（Spices） 是日常烹调中常用的天然调味品，不仅具有增进食欲、改善风味作用，还兼具有杀菌、防腐和抗氧化功能[1]。目前，油脂或富含油脂食品中常用抗氧剂主要有BHA、BHT、PG 和TBHQ等人工合成抗氧剂[2]，但是他们存在一定的毒性问题[3]，部分国家已禁止使用。

小茴香是多年生草本植物，在我国各地均有栽培，历史悠久，其果实、茎、叶均可入食用。小茴香籽具有特殊香气[4]，是一种药食两用香辛料[5]。相关学者已对小茴香籽的挥发油成分等进行了较多的研究[6-7]。

目前，关于响应曲面法优化小茴香籽抗氧化物的提取工艺未见报道，以小茴香籽为原料，通过响应曲面法优化提取小茴香籽抗氧化物，测定其清除自由基能力，为小茴香籽综合开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

722 型分光光度计，山东博科科学仪器有限公司产品；中药粉碎机，河南华康宏力医疗器械有限公司产品；分样筛，新乡市盛禾机电设备有限公司产品；旋转蒸发仪，巩义予华仪器有限公司产品；电子天平，上海菁海仪器有限公司产品；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产品。

DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy；sigma，USA产品；其他试剂均为分析纯；小茴香籽，购自当地农贸市场。

1.2 试验方法

1.2.1 抗氧化物质的提取

准确称取不同粒度的小茴香籽粉末10.00 g，放入500 mL 三角瓶中，然后在加入乙醇（95%），60 ℃下进行回流提取10 h，过滤，上清液经旋转蒸发仪浓缩，分别按照公式（1） 计算提取率，公式（2） 计算DPPH 自由基清除率，以提取物得率和DPPH 自由基清除率之和为综合指标，考查不同因素对综合指标的影响。重复测定3 次。

（1） 抗氧化物得率计算公式。

式中：R——得率，%；

m1——小茴香籽浓缩后提取物的质量，g；

m2——小茴香籽粉末的质量，g。

（2） DPPH 自由基清除率测定。参考黄小凤等人[8]的方法，取不同浓度2 mL 提取物及对照溶液加入0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液2 mL，摇匀，室温下避光保存30 min，于波长517 nm 处测定吸光度。以DPPH 溶液和乙醇溶液为空白，按照公式（2） 计算DPPH 自由基清除率。重复测定3 次。

1.2.2 单因素试验

以乙醇（95%） 为提取剂，分别考查粉碎粒径、提取时间、料液比等因素对综合指标的影响，确定最优的水平。

1.2.3 响应面优化试验

采用响应面Box-behnken（BBD） 中心组合设计进行试验，考查粉碎粒径（X1）、提取时间（X2）、料液比（X3） 3 个因素对小茴香籽提取物得率（1.2.1（1）） 的影响。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.3 抗氧化能力测定

1.3.1 ABTS+·清除能力 （ABTS 法）

参考林大都等人[9]的方法。

1.3.2 清除羟自由基活性的测定

参考李敏等人[10]的方法。

1.4 数据统计分析

数据统计分析采用Microsoft Excel 2017、SAS 8.2 软件进行，数值表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 粉碎粒径对小茴香籽提取物的影响

设定提取时间1 h，料液比15∶1（g∶mL），依次考查0.60，0.45，0.30，0.20 mm 粉碎粒径对小茴香籽提取物综合指标（综合指标见1.2.1 所述方法，综合指标中DPPH 自由基清除率测定时选用小茴香籽提取物质量浓度为6 mg/mL） 的影响。

粉碎粒径对小茴香籽提取物提取综合指标的影响见图1。

图1 粉碎粒径对小茴香籽提取物提取综合指标的影响

由图1 可知，随着粉碎粒径的逐渐减少，小茴香籽提取物综合指标是先升高后缓慢减小，当粉碎粒径为0.45 mm，小茴香籽的综合指标达到最高。

2.1.2 提取时间对小茴香籽提取物的影响

设定粉碎粒径为0.45 mm，料液比15∶1（g∶mL），考查提取时间1.0，1.5，2.0，2.5 h 对小茴香籽提取物综合指标的影响。

提取时间对小茴香籽提取物综合指标的影响见图2。

图2 提取时间对小茴香籽提取物综合指标的影响

由图2 可知，随着提取时间的延长，小茴香籽提取物综合指标先升高后缓慢降低，当提取时间为1.5 h，小茴香籽提取物综合指标达到最高。

2.1.3 料液比对小茴香籽提取物综合指标的影响

设定粉碎粒径为0.3 mm，提取时间1 h，按照料液比为 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 （g∶mL）分别进行提取试验，考查料液比对小茴香籽提取物综合指标的影响。

料液比对小茴香籽提取物综合指标的影响见图3。

图3 料液比对小茴香籽提取物综合指标的影响

由图3 可知，随着料液比的增大，小茴香籽提取物综合指标是先升高后减低，当料液比为1∶15（g∶mL），小茴香籽提取物综合指标达到最高。

2.2 响应面法优化试验

以小茴香籽提取物的得率为考核指标，对小茴香籽提取的工艺条件进行响应面试验设计。根据表2的数据对小茴香籽提取物的得率进行统计分析。

响应面试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面试验结果

由表3 可知，X1对小茴香籽提取物得率影响达到了极显著水平（Pr=0.004 321＜0.01），X3对小茴香籽提取物综合指标影响达到了显著水平（p=0.027 23＜0.05），二次项（X1X1、X2X2、X3X3） 也达到了极显著水平 （p 均小于 0.01）。模型的 p 值 （0.000 943）＜0.01，差异达到了极显著，相关系数R2为98.05%，这些均表明回归模型的拟合度较好。通过SAS 中（RSRGE） 优化，可得出回归方程为：

表3 方差分析

通过方程求解，可求出小茴香籽提取物得率最优水平组合为粉碎粒径0.45 mm，提取时间2 h，料液比 1∶15 （g∶mL）。

为进一步分析各种因素对小茴香籽提取物得率的影响，通过SAS8.2 响应面可得到双因素影响图。

双因素对小茴香籽抗氧化物得率的影响见图4。

响应面图中，曲面越陡，表明两因素对响应值（得率） 影响也越大。图4（a） 表示粉碎粒径（X1）和提取时间（X2） 对响应值的影响，趋势呈先增大后减小；图4（b） 表示粉碎粒径（X1） 和料液比（X3） 对响应值的影响，趋势是先增大后减小；图4（c） 为提取时间（X2） 和料液比（X3） 对响应值的影响，呈先增大后减小的趋势。趋势图分析得知，该模型有最大值，在得率最大条件下，验证试验得率为4.24%，得率与模型预测相近，说明此模型切实可行。

图4 双因素对小茴香籽抗氧化物得率的影响

2.3 抗氧化能力测定

2.3.1 ABTS+·清除作用

ABTS[2,2'-Azino-bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sul phoniate)]经氧化可形成稳定的ABTS+·，被测物质加入ABTS+·溶液后，能与ABTS+·溶液发生反应，从而使反应体系褪色[11]。

小茴香籽提取物对ABTS+·清除能力见图5。

图5 小茴香籽提取物对ABTS+·清除能力

由图5 可知，不同质量浓度的小茴香籽提取物均对ABTS+·有清除作用，清除率与质量浓度呈正相关关系。随着小茴香籽提取物与BHT 质量浓度逐渐增加，ABTS+·的清除率也呈逐渐递增趋势，但小茴香籽提取物对ABTS+·的清除率低于同质量浓度的BHT。

2.3.2 ·OH 清除作用

为了更进一步小茴香籽提取物抗氧化活性，采用1.3.2 的方法测定小茴香籽提取物对·OH 清除能力试验。

小茴香籽提取物对·OH 清除能力见图6。

图6 小茴香籽提取物对·OH 清除能力

由图6 可知，不同质量浓度的小茴香籽提取物均对·OH 有清除作用，清除率与质量浓度也呈正相关关系。随着质量浓度增加，两者对·OH 的清除率也逐渐升高，小茴香籽提取物对·OH 清除能力也低于同质量浓度的BHT。

3 结论

（1） 小茴香籽提取物提取单因素工艺的试验表明，小茴香籽提取物的最佳工艺条件为粉碎粒径0.45 mm，提取时间1.5 h，料液比15∶1（g∶mL），此时小茴香籽提取物综合指标达到最大值。

（2） 小茴香籽抗氧化物响应面优化试验结果表明，粉碎粒径（X）1对小茴香籽提取物得率影响达到了极显著水平 （p=0.004 321＜0.01），料液比 （X）3对小茴香籽提取物得率影响达到了显著水平（p=0.027 23＜0.05），二次项 （X1X1、X2X2、X3X）3也达到了极显著水平 （p 均小于 0.01）。模型的 p（0.000 943） ＜0.01，差异极显著，相关系数R2为98.05%，回归模型的拟合度较好。通过SAS 中（RSRGE） 优化，小茴香籽提取物得率最优水平组合为粉碎粒径0.45 mm，提取时间2 h，料液比15∶1（g∶mL）。

（3） 小茴香籽提取物体外抗氧化试验表明，在质量浓度2～10 mg/mL 条件下，小茴香籽提取物对ABTS+·清除率及·OH 清除率呈随提取物的质量浓度增加而增大的变化趋势。