高职高专院校黄酮类物质提取实验教学设计——以槐米中芦丁的提取工艺为例

冯文婕

(浙江经贸职业技术学院应用工程学院，浙江 杭州 310018)

天然产物提取分离实验课程的任务是介绍各种天然产物的物理、化学性质，结合物质特性选择适宜的提取分离技术进行天然产物的制备，通过实验教学使学生掌握常见天然产物的制备工艺和原理，培养学生生产实践的能力[1-2]。

芦丁是一种常见的黄酮类天然产物，也是槐米的主要的功能性成分，槐米中芦丁含量一般在12%～20%[3]。芦丁具有显著的抗氧化活性、抗肿瘤、抗病毒等功效，常常用于开发各类功能性产品。医药工业方面也常常利用芦丁为原料，开发心脑血管疾病方面的治疗药物[4-5]。由于芦丁具有非常广泛的生理和药理活性，学习并掌握芦丁的提取工艺技术具有重要的意义。同时，芦丁具有黄酮类化合物典型的理化性质，《槐米中芦丁的提取》这个实验项目是一个比较典型的黄酮类化合物提取分离的综合性实验，可以通过学习槐米中芦丁的提取制备，掌握黄酮类化合物的主要提取工艺技术[6]。

黄酮类化合物分子内由于含有酚羟基而呈弱酸性，提取黄酮类化合物最常用的方法是碱提酸沉法，即先用碱性溶液提取，再加酸酸化后沉淀析出；由于黄酮类化合物大多具有较大极性也可选择乙醇等极性溶剂回流提取[7-8]。因此本实验项目教学设计以槐米为原料，通过碱提酸沉法、乙醇回流提取法等工艺方法提取芦丁，比较不同提取工艺条件对槐米中芦丁的提取效率的影响。同时通过拓展实验对比分析超声辅助提取法、微波辅助提取法等其他提取工艺的优劣。

1 实验方案设计

本实验方案共计8个学时，包括芦丁的提取、芦丁的分离纯化、芦丁的定性定量分析3个实验项目，以及超声辅助法提取芦丁或微波辅助法提取芦丁1个拓展实验项目。通过芦丁的提取掌握碱提酸沉法、乙醇回流提取法提取黄酮类化合物的工艺技术，掌握碱提酸沉法中溶液pH值的控制、乙醇浓度等工艺条件的选择；通过芦丁的纯化，了解重结晶分离纯化的方法和技术要点；通过芦丁的定性定量分析，学会评价工艺的优劣，选择出最佳工艺条件；通过拓展实训项目了解更多、更新的提取工艺方法。整个实验内容综合了黄酮类化合物提取、分离、纯化、鉴别和测定等多个知识点和技能点，有利于学生综合实践应用技能的训练和培养。

2 实验项目操作方案

2.1 实验原理

芦丁是多羟基黄酮化合物，因含有酚羟基而具有酸性，易溶于碱性溶液生成弱酸强碱盐，再加入酸和盐反应，生成游离态的黄酮，并逐渐沉淀析出。

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 实验材料和试剂

实验原料为槐米；实验试剂包括：芦丁对照品；乙醇(分析纯)；盐酸(分析纯)；硝酸铝(分析纯)；亚硝酸钠(分析纯)；碳酸氢钠(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；石灰乳；锌粉(或镁粉)；蒸馏水。

2.2.2 实验仪器

万分之一电子天平；电炉、回流提取装置、恒温水浴锅；可见紫外分光光度计；真空干燥箱；真空泵；普通玻璃仪器若干。

2.3 芦丁的提取工艺

开展实验教学时，全班30人为例，以3人为一个小组，开展实验，不同的小组按照不同的提取工艺条件进行实验，最后全班各小组对比提取率和得率，得出最佳提取工艺条件，并分析讨论原因。

称取槐米20 g，分别采用碱提酸沉法、乙醇回流提取法、碱性乙醇回流提取法等不同提取工艺条件提取槐米中的芦丁。具体操作步骤如下：

碱提酸沉法：称取槐米20 g置于500 mL烧杯中，加人蒸馏水300 mL，在搅拌下加入石灰乳，调节pH值使溶液呈碱性，然后电炉丝加热至微沸，保持30 min(注意及时补充挥发的水分以保持溶液pH值不变)，趁热纱布过滤。待溶液冷却至 60～70 ℃时，用浓盐酸调节溶液pH值至酸性，静止待芦丁沉淀析出，滤出结晶沉淀，烘干称重。

乙醇回流提取法(或碱性乙醇回流提取法)：称取槐米20 g置于圆底烧瓶中，加入一定量的乙醇溶液(或含碳酸氢钠的碱性乙醇溶液)，并在中水浴加热回流提取60 min，趁热纱布过滤，用浓盐酸调节溶液pH值至酸性，静止待芦丁沉淀析出，滤出结晶沉淀，烘干称重。

各方法具体提取工艺条件见表1所示。

表1 分组开展槐米中芦丁提取的工艺条件Table 1 Technological conditions of rutin extraction from sophora japonica in groups

碱提酸沉法重点分析碱提的pH值和酸沉的pH值对于提取效果的影响，并通过实验结果讨论分析，过酸或过碱对于提取效率的影响。乙醇回流提取法，重点分析讨论料液比和乙醇浓度对于提取效率的影响，以及碱性条件下是否更有利于提高乙醇回流提取效率。

2.4 芦丁过的分离纯化

将沉淀结晶放入烧杯中，加人适量蒸馏水加热至全部溶解并保持微沸15 min，然后趁热抽滤，将滤液冷却静置，析出结晶后，再抽滤，并将结晶在60～70 ℃ 下干燥，得到精制芦丁。

2.5 产品的定性定量分析

2.5.1 产品的定性分析

在提取、分离纯化等各个环节结束后对提取产品进行定性分析，芦丁是黄酮苷类物质，因此芦丁的显色反应同时满足黄酮类的显色反应和苷类的显色反应。

盐酸-锌粉(镁粉)反应：取少量结晶于试管中，用少量95%乙醇溶液溶解，加入少量锌粉(或镁粉)，滴加几滴浓盐酸，1～2 min内，观察颜色变化，必要时可加热反应。由于芦丁属于黄酮类物质，盐酸-锌粉(镁粉)反应后会溶液会呈现红色或粉红色。

α-萘酚反应：取少量结晶于试管中，用少量95%乙醇溶液溶解，加入1 mL10%α-萘酚溶液，倾斜试管，摇匀，沿管壁缓慢滴加1 mL浓硫酸，不要震荡，注意观察两界面产生的变化。由于芦丁是黄酮苷类物质，分子里除了含有黄酮母核，还有含糖基，故进行α-萘酚反应时，溶液两层界面之间会有紫环产生。

2.5.2 芦丁标准曲线制作

先将芦丁对照品放置在105 ℃干燥箱中干燥，精密称量 20 mg，放置于100 mL容量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，接着移液管吸取3，4，5，6，7 mL，分别加入到25 mL的容量瓶中，再加入1 mL的5%NaNO2溶液，混合6 min后，再加入1 mL的1.0% Al(NO3)3，混合6 min后，加入10 mL的4%NaOH，最后用60%乙醇溶液至刻度，混合10 min后在512 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线。标准曲线的制作可以由值日生完成，供全班同学用。

2.5.3 产品的芦丁含量的测定

精密精制后的芦丁产品20 mg，放置于100 mL容量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度后，吸取3 mL加入到25 mL的容量瓶中，再加入1 mL的5%NaNO2溶液，混合6 min后，再加入1 ml的1.0%的Al(NO3)3，混合6 min后，加入10 mL的4%NaOH，最后用60%乙醇溶液至刻度，混合10 min后在512 nm处测定吸光度，并计算芦丁的含量。

2.5.4 提取率和得率的计算

通过芦丁的提取效率来作为提取工艺条件的评价指标，通常包括提取率和得率两项指标[9-10]。其中得率和提取率计算公式如下：

(1)

(2)

3 拓展实验

超声波辅助提取法提取芦丁，主要利用超声波辐射产生的强烈的空化效应、界面效应、湍流效应和聚能效应等作用，破坏原来细胞，促进细胞内含物的溶出和传递，有利于低温下快速提取的目标产物。可以在超声波辅助情况下，进行碱提酸沉法或乙醇提取法，加快提取效率。

微波辅助提取法提取芦丁，主要通过微波加热辅助碱提酸沉法，利用的是微波的热效应来促进介质转动和能级跃迁。同时，微波具有较强的穿透力，且选择性高等优点，有利于提高产品的提取效率。

拓展实验部分的实验教学主要以教师讲解和演示实验为主。通过演示实验学习超声辅助法、微波辅助提取法的主要实验原理、操作步骤和操作要点等。

4 实验效果评估

本实验设计符合高职高专类院校天然产物提取分离课程的教学要求，通过实验教学，学生能够较系统地、完整地掌握黄酮类化合物提取工艺技术。通过实操实验和演示实验掌握多种提取工艺，并分析各提取工艺的优缺点；通过小组横向对比分析，得出最佳提取工艺条件。

碱提酸沉法提取黄酮类物质时，关键在于控制溶液的酸碱度，过酸过碱都会降低提取效率。通过小组实验结果比对可以帮助学生更好地理解这一关键点，同时得出最佳的酸碱度。乙醇回流提取和碱性乙醇回流提取法提取黄酮类物质时，关键在于乙醇浓度和料液比。通过小组实验结果对比分析，可以得出最佳的提取条件。通过分组按照不同工艺条件实训，每个同学在掌握两个最主要的提取工艺的前提下，各组横向对比，讨论分析最佳提取条件。这也要求每个小组的成员要认真完成每一个实训内容，才能获得准确的实训数据供大家分析。

5 结 语

本实训项目教学设计以槐米为原料，通过碱提酸沉法、乙醇回流提取法等工艺方法提取芦丁，比较不同提取工艺条件对槐米中芦丁的提取效率的影响。同时通过拓展实验对比分析超声辅助提取法、微波辅助提取法等其他提取工艺的优劣。该实训项目综合性较强，在培养学生掌握黄酮类提取工艺技术的同时，培养学生的主观能动性和综合分析能力，有利于培养学生的工匠精神。教学环节设计方面，突出各小组团队合作，有利于培养学生的集体意识和团队合作精神。