天然药物化学课程系统预实验的探索与实践*

李艳平，蔡 锋，何红平

(云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500)

天然药物化学是中医药院校药学类、制药工程、药物制剂类专业核心课之一，这是一门实践性非常强的课程，通过理论知识和实践技能的融合，培养具备从事天然药物生产和研发相关能力的学生。天然药物化学实验课程的设计主要包括天然药物开发过程中的样品的提取、分离纯化、性质检识和结构鉴定[1]。各本专科院校在天然药物化学实验课上常开设的实验主要是传统经典一些提取分离实验，主要包括：大黄中蒽醌类成分的提取及应用pH梯度萃取法对其分离纯化，槐米中芦丁的提取、纯化、水解和检识，盐酸小檗碱的提取分离检识、薯蓣皂苷元的提取分离和鉴定等，采用到的实验方法也主要是常规的煎煮法、回流提取法、超声提取法、结晶以及重结晶操作等[2]。近年来，随着药学学科的快速发展，国家也越来越重视中医药现代化，天然药物以原料药和提取物的形式出口额度也逐年增加，国家对具备天然药物提取分离技术的人才的需求也大量提升[3]。加之现代社会更加鼓励和提倡对药学专业领域研究内容的创新，传统单一的实验内容和操作难以满足综合应用型天然药物研发人才的培养要求，这就需要从药学专业的深度、系统性、综合性以及创新性方面来对天然药物化学实验进行改革和更新[4]。

天然来源的药物中所含的化学成分比较复杂，在研究其化学成分之前，一般应先进行预试验，初步了解其中可能含有哪些类型的成分，以便对提取、分离工作提供有益的参考，预试验一般可分为两大类：一类是单项预试验，即可根据需要，重点检查某类化学成分的存在与否[5]，这也是大多数天然药物化学实验所涉及的。另一类是系统预试验，首先根据天然药物中所含各类化学成分在不同极性的溶剂中的溶解度不同，利用相似相溶原理，用不同极性的溶剂将其提取出来，分为极性不同的几个部分，再用各类成分的定性反应(包括沉淀和显色反应等)及层析法(薄层色谱、纸色谱等)检查，最后综合分析判断各类成分的有无或存在的可能性。这就要求学生在做天然药物化学成分预实验前，首先须熟悉天然药物化学成分各主要结构类型的性质、检识反应，能对试验结果进行综合初步判断。对学生的综合应用能力、综合操作能力、实验过程中分析解决问题的能力均能得到更好的培养。本文将以实例形式对我校实际开设的天然药物化学系统预实验实验设计、学生操作、考核评价以及学生能力培养等方面进行探索和总结。

1 实验设计

1.1 实验药材样本的选择

在实验的样本选择方面，我们除了选择一些富含各类化学成分的经典中药之外，还专门的选择了一些云南特有的天然药物，以便学生在完成实验之后，通过文献检索，了解更多我们身边的特色天然药物。为了增加实验的深度和系统性，我们将2～3种粉碎的药物混合在一起(见表1)，使得学生在成分检测的过程中有更多的阳性结果，充分的综合分析试验。

表1 天然药物化学系统预实验药材样本设计表Table 1 Design of medicinal materials in system preliminary experiments of natural medical chemistry

1.2 实验分组

以48人的班级为例，我们设置每3个人为一组，准备16份混合药材样品，每组同学可以随机抽取一个药材样品编号，保证每组的样品不重复，而每组药材的组成也不同，这样可以避免了同学之间相互的借鉴抄袭，还能培养学生独立思考独立操作的能力。

1.3 实验方法

1.3.1 预试验溶液的制备

用室温浸泡过夜的方法制备冷水浸液，用来检查检查氢基酸、多肽和蛋白质。

药材样品于水浴上60 ℃左右热浸半小时，趁热过滤制得热水提取液，用于供检查糖、多糖、有机酸、皂苷、苷类、酚类、鞣质等成分用。

95%乙醇水浴上加热回流一小时，稍冷后加入蒸馏水使其含醇量为70%，滤液在分液漏斗中用石油醚(60～90 ℃)分两次萃取除去叶绿素等，分出下层乙醇提取液，浓缩至小体积后检查黄酮、蒽醌、香豆素、萜类、甾体化合物、内酯类化合物、强心苷、有机酸、酚类、鞣质等成分。

0.5%硫酸的乙醇溶液于水浴上加热回流制备酸性乙醇提取液用来检查生物碱。

用石油醚(60～90 ℃)室温浸泡提取2～3 h，过滤得石油醚提取液，用来检查脂溶性的挥发油、萜类和甾体化合物。

1.3.2 各类成分的检查

检查生物碱类成分取酸性乙醇提取液先用稀氨水调至中性，于水浴上蒸干，残渣加5%硫酸溶解过滤，滤液用碘化铋钾试验、碘化汞钾试验、硅钨酸试验，观察沉淀的产生及颜色。

检查水溶性成分如氨基酸、多肽和蛋白质类时所用到的实验有加热沉淀试验、双缩脲试验、茚三酮试验以及吲哚醌试验，观察沉淀的产生及颜色变化。

检查还原糖、多糖和苷类化合物时所用到的实验有菲林反应、α-萘酚试验、还原性多糖的试验等，记录观察沉淀的产生及颜色变化。

检查皂苷类时所用到的实验有泡沫试验、醋酐-浓硫酸反应、溶血试验，观察并记录现象。

检查有机酸类成分时所用到的实验有pH试纸试验、溴酚蓝试验、溴甲酚绿试验。

检查酚类化合物和鞣质类成分时所用到的实验包括三氯化铁试验、三氯化铁—铁氰化钾反应、香草醛—盐酸反应和明胶试验，观察并记录现象。

检查甾体及三萜类化合物所用到的实验有醋酐-浓硫酸反应、氯仿-浓硫酸反应、三氯醋酸反应等。

检查黄酮类化合物所用到的实验包括盐酸-镁粉反应、三氯化铝反应、醋酸镁反应、氨熏试验等。

检查内酯、香豆素及其苷类所用到的实验为荧光试验、重氮化反应、异羟肟酸铁反应。

检查强心苷类所用到的实验为3，5一二硝基苯甲酸反应(Kedde反应)、碱性苦味酸反应(Baljet反应)、亚硝酰铁氰化钠反应(Legal反应)。

检查蒽醌类所用到的实验为碱液试验、醋酸镁反应和硼酸溶液试验。

检查挥发油、油脂类所用到的实验为油斑试验、磷钼酸试验、香草醛-硫酸试验。

1.3.3 各类成分的层析检查

天然药物化学成分的预试验除用上述的定性反应外，还可需要用层析法进行进一步的检查和确认，展析结果容易判断，可减少成分间的相互干扰。还可以根据层析种类、条件、展开剂组成以及色斑的比移值(Rf值)初步判断样品中所含化学成分的溶解性能和极性大小，也可以通过与标准样品对照，初步判断样品中所含化合物种类。此外，我们也会提前给同学们提供一些各类化学成分的参考层析条件供参考。例如生物碱类：(1)氧化铝层析(中性、碱性)展开剂：氯仿-甲醇(9:1)或苯-甲醇(8:2)显色剂可用改良碘化铋钾试剂；(2)硅胶薄层色谱展开剂(常含碱性溶剂以防止脱尾)：石油醚-二乙胺(9:1)、氯仿-丙酮-二乙胺(5:4:1)或氯仿-甲醇-二乙胺(7:3:0.2)，显色剂：改良碘化铋钾试剂。

1.3.4 系统预实验结果要求

要求每组学生协同合作对以上的实验内容进行提取、萃取、过滤、成分检识、层析检识实验，综合分析试验结果，得到实验结论，结论中要求明确所选择的药材样品中一定含有的两类成分、可能含有的成分、不含的成分。并通过薄层色谱检识一定含有的成分，计算比移值(Rf值)。最后，根据实验老师提供的药材组成通过查阅文献，总结反思在系统预实验过程中的经验和教训，并根据检索到的文献和自己实验的结果设计样品中其中一味药材中主要成分的提取、富集、分离的方法，完成实验报告的撰写。

2 学生操作

以药材N包含槐米和黄连的混合药材为例，槐米是豆科植物槐干燥的花蕾，是一种天然抗氧化剂，其中主要含黄酮、皂苷、甾醇等成分。以黄酮类成分芦丁为主，此外还含有其它多种化学成分包括槲皮素、染料木素、异鼠李素等[6]。而毛茛科黄连属植物黄连中富含小檗碱、黄连碱、掌叶防己碱等生物碱，可用于治急性结膜炎、急性细菌性痢疾、急性肠胃炎等症[7]。因此这两者的混合得到的药材N主要检测的目标是黄酮和生物碱类成分。在学生并不知道药材组成的情况下，同学们通过对N药材的水提液、95%乙醇提取液、酸性乙醇提取液以及石油醚提取液的检查，得到结果见图1。

图1 实验结果展示Fig.1 Display of experimental results

学生通过多种提取方法、较为全面的各类化合物的检查，自己设计并记录实验结果的表格，将试验结果及清楚明了的记录结果的图片彩打并粘贴于实验报告上，在数据分析时清晰准确，结论简洁明了。

3 考核评价

天然药物化学系统预实验的考核和效果评价包括4个方面：(1)自学能力评价，包括预习报告， 相关资料查阅， 相关操作方法熟悉程度。(2)实验操作评分， 实验老师在学生实验过程中观察学生基本操作、仪器使用、动作的规范性和熟练程度熟练制定A(优)、B(良)、C(合格)、D(不合格)四个等级。(3)实验过程中学生团队合作以及分析解决问题的情况评分。(4)根据实验的原始记录、实验报告、实验结果分析、及查阅文献设计的实验流程图正确性、完善性进行评分。(5)学生通过完成实验的自我评价。综合以上五个方面，得到最终的实验成绩。这种综合评分， 能从实践技能掌握到主观能动性提升以及开拓创新能力培养方面反映了以素质教育为主导的学生对实验掌握的真实情况。

4 学生能力培养

在天然药物化学实验课教学的实施过程中，系统预实验会放在实验课程的最后一次，同时也作为一种实验考核，老师在第一次实验课开始时就告知学生系统预实验的整体构思和目的意义，提前给学生较长的时间来学习各种实验方法，做好操作技能和思想上的准备，这一阶段可以从思想是上加强学生对必须实验技术的掌握，培养学生自学能力、认真思考和创造性思维的训练能力。在系统预实验执行的过程中，老师只提供相应的提纲性的实验方法和检查项目，并不是让学生按照既定的步骤操作，因此需要学生提前制订好提取方法，检查所需要的溶剂试剂及具体操作步骤，除了可以巩固学生对学过的理论知识、实验原理的理解，还可以培养学生兴趣，训练的科研素质。操作过程中还能培养学生的团队合作意识，利用团队知识来分析解决问题的能力和动手操作能力。最后，在实验报告的分析撰写阶段，由于系统预实验的结果数据量大，可以锻炼学生对整个数据整理分析凝练总结的能力，以及针对结果的文献检索和举一反三的能力[8]。

5 存在的问题

开设天然药物化学系统预实验的开始内容需考虑到实验室的配置，包括仪器的配备，试剂的使用，实验室安全等。由于实验过程中所涉及的提取方法同时涉及到天然药物化学中的多个提取方法，并且可能需要同时开展，这对实验室仪器设备的准备管理会造成一定的压力。此外，大量的溶剂试剂的使用，对学生实验技能要求较高，如果学生有些基本操作不过关，还可能造成一定的安全隐患。这样的系统预实验类似半开放式实验，也需要比平时多的实验指导老师实时指导学生，否则难以发现学生在实验操作或者突发问题解决方面的不足。同时，对于理论和实践知识掌握均较为扎实也善于融会贯通的学生，这是激发兴趣提升能力很好的锻炼机会，然而对于基础较为薄弱操作能力欠缺的学生而言可能较为困难，容易引发学生的畏难情绪，使得这种培养模式的效果大打折扣。

6 结 语

以这种类似半开放式实验教学的形式开展天然药物化学的系统预实验，不同于以往以教师为重心， 讲解实验原理、给出实验具体步骤，学生按部就班操作，无法很好地反馈提升的形式，强调了学生主体的作用。教师由单一的“教”转变于“引导”， 培养了学生分析解决问题的能力， 锻炼了学生们自学能力、独立思考及独立操作的能力， 为学生创造性思维的发挥以及实施提供了平台， 符合现代药学教育改革的需要，对药学类本科实践教学具有重要意义。