DJ-1、miR-20b-5p在子宫内膜异位症中的表达及与抑癌基因PTEN的关系

武 童 王清萱

北京市顺义区妇幼保健院，北京儿童医院顺义妇儿医院(101320)

子宫内膜异位症(EMT)指子宫内膜组织(腺体和间质)生长在子宫腔与子宫肌层意外的部位[1]。以25～45岁居多，发病率为10%～15%，近年呈上升趋势[2]。目前，尚不明确EMT病因，但有研究显示细胞异常凋亡为EMT发病重要因素[3]。DJ-1为新近发现的一种参与细胞周期调节的癌基因，被证实在多种恶性肿瘤中异常表达[4]。已有研究表明，微小RNA(miRNAs)在EMT多环节中扮演关键角色[5]，其中miR-20b-5p为miR-106a-363基因簇成员之一，具有促进肿瘤细胞增殖作用。PTEN是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,也是继p53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的基因[6]。本研究探讨DJ-1、miR-20b-5p在EMT组织中表达及与PTEN相关性，为EMT发病机制研究提供一定参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择2019年3月-2021年3月本院收治的行腹腔镜手术治疗EMT患者65例在位内膜(Eu组)、异位内膜(Ec组)，同期行子宫肌瘤剔除术且排除EMT 60例正常内膜组织(对照组)。所有患者月经周期正常，近6个月未接受性激素或其他方式治疗，排除其他内外科合并症、恶性肿瘤，内膜周期根据月经周期及病理结果划分。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 检测方法

所有受试者均于术中无菌采集组织标本，4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)内固定。免疫组化检测：取组织石蜡包块，常规切片、脱蜡处理；高压修复抗原；阻断灭活内源性过氧化物酶；滴加羊血清封闭；滴加PBS稀释至1:500兔抗人DJ-1一抗/1:200兔抗人PTEN一抗，PBS冲洗；滴加经辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗；滴加链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶(SP)；DAB显色，苏木素复染；脱水、透明、封片、镜检。设置PBS代替一抗为阴性对照。qRT-PCR检测：取3组内膜组织30mg，采用TRIzol试剂盒提取总RNA，用分光光度计测定总RNA纯度、浓度，将提取总RNA采用cDNA合成试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，DJ-1、miR-20b-5p以U6为内参，PTEN以β-actin为内参进行PCR扩增，引物序列均由北京天根生化科技有限公司设计合成，见表1。反应体系：1μl cDNA、上下游引物各1 μl、25 μl Easy Taq RCR SuperMix(2×)、22 μl ddH2O，共50μl；反应条件：94℃、5min→94℃、30s→59℃、30s→72℃、1min，共32个循环。②miR-20b-5p：反应体系：2 μl cDNA、上下游引物各0.8 μl、10 μl SYBR Premix Ex Taq II(2×)、6.4 μl ddH2O，共20 μl；反应条件：95℃、1min→94℃、15s→55℃、30s→72℃、40s，共45个循环。③PTEN：2μlcDNA、上下游引物各1 μl、25 μl SYBR Premix Ex Taq II(2×)、22 μl ddH2O，共50μl。使用试剂：兔抗人DJ-1多克隆抗体(北京博蕾德生物科技有限公司)、兔抗人PTEN多克隆抗体(美国Abcam公司)、免疫组化SP-9000试剂盒、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TRIzol试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、cDNA合成试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)。

表1 PCR扩增引物序列

1.3 结果判断

免疫组化：由2位高年资病理医师双盲法单独阅片，于高倍光学显微镜镜下(×400倍)随机选择5处视野，每处视野选取100个细胞，以阳性细胞占比和染色强度乘积(IS值)判定。①DJ-1：阳性细胞占比：≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，染色强度：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，IS值为0分代表阴性，IS值≥1分代表阳性；②PTEN：阳性细胞占比：<1%计0分，1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，>80%计4分，染色强度：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，IS值≤4分为阴性，IS值>4分为阳性；③qRT-PCR：根据2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量，记录3次实验结果取平均值纳入统计研究。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

EMT患者年龄(35.1±9.7)岁(25～45)岁，内膜周期为增殖期28例、分泌期37例；对照组年龄(35.1±9.8)岁(24～45)岁，内膜周期为增殖期25例、分泌期35例。两组年龄、内膜周期比较无差异(P>0.05)。

2.2 组织中DJ-1、PTEN蛋白表达比较

Eu组共65份标本，Ec组共81份标本，对照组共60份标本。免疫组化结果显示，对照组、Eu组、Ec组 DJ-1蛋白表达水平(0.08±0.01、0.16±0.05、0.23±0.07)逐渐升高，PTEN蛋白表达水平(0.15±0.04、0.08±0.02、0.03±0.01)逐渐降低(F=143.486、410.290，均P<0.001)。见表2。

表2 各组指标两两成对比较

2.3 组织中DJ-1、miR-20b-5p、PTEN mRNA表达比较

qRT-PCR结果显示，DJ-1、miR-20b-5p mRNA表达水平对照组、Eu组、Ec组依次升高，PTEN mRNA表达水平对照组、Eu组、Ec组依次降低(均P<0.001)。见表3、4。

表3 各组组织中DJ-1、miR-20b-5p、PTEN mRNA表达水平比较

表4 各组指标两两成对比较

2.4 DJ-1、miR-20b-5p mRNA与PTEN mRNA表达关系

Pearson相关分析显示，DJ-1、miR-20b-5p mRNA与PTEN mRNA表达水平均呈著负相关(r=-0.716、-0.587，均P<0.01)。

3 讨论

DJ-1系丝裂原依赖性癌基因之一，其所编码蛋白具有多重功效，在人体各组织内广泛分布，且以二聚体形式参与多种细胞生命活动。DJ-1和多种恶性肿瘤发生、进展以及预后有关[7]。Qiu等[8]研究表明，DJ-1在甲状腺癌中异常表达，且与肿瘤细胞侵袭、转移有关；游莉斯等[9]研究显示，DJ-1在胰腺癌血清中高表达，且其水平可能为胰腺癌患者预后的生物标志物；朱小坚等[10]研究指出，DJ-1可调控p53信号通路促使结直肠癌细胞增殖和上皮-间质转化发生。本研究结果表明，DJ-1蛋白及mRNA在Eu组、Ec组组织中表达水平均高于对照组，且Ec组表达水平高于Eu组，提示DJ-1可能参与了EMT的发病过程。

研究表明，EMT组织中miRNAs表达异常[11]，miR-23、miR-29c、miR-183、miR-196、miR-200b等在EMT细胞增殖、黏附、侵袭、转移、凋亡等生物学进程中扮演重要角色。miR-20b-5p定位于性染色体Xq26.2上，该区域系染色体脆性区域，miR-20b-5p基因突变和人体各种肿瘤发生有关。李海龙等[12]报道，miR-20b-5p在胃癌细胞系以及组织中高表达，可作为潜在胃癌生物标志物；Arora S等[13]研究显示，miR-20b-5p在非小细胞肺癌发病、进展过程中具有重要意义。本研究结果表明，miR-20b-5p mRNA在Eu组、Ec组组织中表达水平均高于对照组，且Ec组高于Eu组，提示miR-20b-5p和EMT发生密切相关。

PTEN为一类具备脂质磷酸酶及蛋白磷酸酶的双特异磷酸酶活性抑癌基因，同时也为调控细胞增殖、凋亡重要信号传导分子。研究证实，异位内膜长时间存在不但与内膜细胞凋亡能力下降有关，而且和异位内膜细胞增殖能力变化有关。储巧香[14]报道提出，PTEN可抑制整合素介导细胞延展过程，使细胞黏附能力降低，而PTEN表达缺失使内膜细胞侵袭、转移能力明显增强，致使内膜细胞转移至肌层/盆腔腔膜内诱发EMT。Akbarzadeh等[15]研究，PTEN缺失致促凋亡能力降低，破坏细胞增殖/凋亡平衡，引起细胞种植生长，导致EMT发生。本研究结果表明，PTEN蛋白及mRNA在Eu组、Ec组表达水平均低于对照组，且Ec组表达低于Eu组，提示PTEN可促进细胞凋亡，从而抑制EMT发生。

本研究结果显示，DJ-1、miR-20b-5p mRNA与PTEN mRNA表达呈显著负相关，提示DJ-1、miR-20b-5p可能通过负性调节PTEN表达影响细胞增殖，从而参与EMT的发病过程。分析原因为[16-17]：DJ-1表达升高增强异位内膜细胞增殖能力，并抑制PTEN磷酸酶活性，使PTEN对PKB/AKT抑制作用失效，激活并磷酸化PKB/AKT，从而破坏细胞增殖/凋亡平衡，导致EMT发生；PTEN为miR-20b-5p所调控靶基因之一，可在转录后抑制其水平表达，从而影响细胞增殖周期进而引发EMT。

综上所述，DJ-1、miR-20b-5p在EMT中表达上调，DJ-1、miR-20b-5p可能通过负性调节PTEN表达水平，增强异位内膜细胞增殖能力，从而导致EMT的发生。