基于LC-MS/MS技术探讨GDM合并妊娠期高血压孕妇血清LPC18:0与肾损伤的相关性

韩 清，周婷婷△，樊娜娜，徐 文

(1.枣庄市妇幼保健院产科，山东 枣庄 277000；2.青岛大学附属医院药学部，山东 青岛 266003 )

GDM是一种妊娠期常见并发症，临床发现GDM孕妇容易合并妊娠期高血压。目前，对于GDM合并妊娠期高血压的具体发病机制尚不清楚，而肾损伤是GDM合并妊娠期高血压的微血管病变的主要表现之一，给母婴健康带来危害。因而，敏感有效的肾脏功能监测指标对GDM合并妊娠期高血压评估尤为重要。目前，研究者在诊断方面的指标如胱抑素、β微球蛋白、同型半胱氨酸等取得了一定成果，但早期诊断仍有一定难度[1]。近年来，研究者通过代谢组学进行一些研究，谭兵等[1]用三重四级杆飞行时间质谱设备筛选出LPC18:0在重度子痫前期孕妇及正常孕妇存在差异。LPC在糖尿病动物中可以促进肾脏炎症和肾小管间质纤维化[2]，从而可以损伤血管内皮细胞引起肾功能损伤。而LC-MS/MS是一种针对性较强代谢谱的分析技术，对设计的代谢物进行定量或半定量测定，达到验证代谢标记物的目的，且在测定样本前经过系统的方法学验证，结果更准确。本文利用LC-MS/MS对可能与GDM合并高血压有关的代谢物LPC18:0水平进行测定，并对其与肾功能损伤的相关性进行研究，希望在早期发现肾损伤，以控制疾病的发展。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2021年1—12月枣庄市妇幼保健院住院的GDM孕妇120例作为观察组，按是否合并高血压分为GDM合并妊娠期高血压组(60例)和GDM组(60例)，入组患者均根据第9版《妇产科学》[3]中相关诊断标准鉴别并确诊。 根据血清LPC18:0水平，将GDM合并妊娠期高血压组分为LPC18:0≥110 μg/mL组(24例)和LPC18:0<110 μg/mL组(36例)，另选同期住院的健康孕妇60例作为对照组。排除标准：存在慢性高血压、多胎妊娠、羊水过少、羊水过多等妊娠相关疾病者; 存在前置胎盘、子宫肌瘤、胎盘早剥、肾病、病毒性肝炎、糖尿病、心脏病、自身免疫性疾病等其他妊娠并发症。所有纳入研究的孕妇均签署了知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 患者于孕周34～40周时采集清晨空腹肘静脉血 5 mL，HbA1c检测采用高压液相层析法，仪器为爱科莱HA-8160全自动HbA1c分析仪。采用西门子ADVIA2400全自动生化分析仪检测空腹葡萄糖(FBG)、血清素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、尿微量白蛋白(UmA1b)、尿微量蛋白/肌酐(ACR)等指标。采用固相竞争化学发光酶联免疫法检测FINS，根据公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。血清LPC18:0水平的检测与处理采用Agilent 1290Ⅱ高效液相色谱仪(配备G7120高压二元泵，G7167B自动进样器，G7116B柱温箱，美国Agilent 公司)、API4000+三重四极杆串联质谱系统和Analyst 1.6.3质谱数据处理软件(美国AB公司)；LPC18:0(纯度大于99%)，所有试剂均由上海蔚霆生物科技有限公司提供。

1.2.2代谢组学样品制备 取禁食6 h研究孕妇的肘静脉血液5 mL于促凝管中，12 000 r/min速度的离心机内离心10 min，取上清液作为样品放置于-80 ℃冰箱中待检。实验时常温解冻，将样本血清常温解冻后,取100 μL样本血清与30 μL甲醇混合，涡旋振荡30 s后,4 ℃下静置5 min。将混合物在4 ℃，离心半径为8 cm，12 000 r/min离心速度的条件下离心5 min，取5 μL上清液待测。

1.2.3代谢组学样本分析[4]色谱条件色谱柱为Ultimate AQ-C18column(3.0 μm,2.1 mm×100 mm，上海月旭科技有限公司)；流动相乙腈(A)-0.1%的甲酸溶液(B)梯度洗脱(0～0.5 min，8% A；0.5～1 min，8%→100% A；1 ～ 6 min，100% A)；流速为0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量为5 μL。质谱条件采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式，质谱参数：碰撞气6×104Pa，气帘气2×105Pa，雾化气4.48×105Pa,辅助气4.48×105Pa，喷雾电压5 500 V，雾化温度550 ℃;负离子模式,质谱参数：碰撞气6×104Pa，气帘气2×105Pa，雾化气4.48×105Pa,辅助气4.48×105Pa,喷雾电压4 500 V,雾化温度550 ℃。LPC18:0的MRM条件为正离子模式。DP 60,CE 40,母离子524.7，子离子184.2。

2 结 果

2.1各组孕妇临床资料比较 各组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组孕妇临床资料比较

2.2各组血清指标水平比较 GDM合并妊娠期高血压组与GDM组血清LPC 18:0，UmA1b，ACR水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。GDM组与正常对照组血清LPC 18:0、FBG、FINS，HbA1c、HOMA-IR水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。LPC18:0≥110 μg/mL组与LPC18:0<110 μg/mL组UmA1b、ACR水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清指标水平比较

注：与GDM组比较，aP<0.05;与正常对照组比较，bP<0.05。

2.3血清LPC18:0水平与血糖及肾功能指标的相关性 Spearman相关性分析结果显示：GDM合并妊娠期高血压孕妇血清LPC18:0水平与BUN、Cr、UmA1b、ACR水平均呈正相关(P<0.05)。与FBG、FINS、HbA1c水平均无相关性(P>0.05)。与HOMA-IR呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 血清LPC18:0水平与血糖及肾功能指标水平的相关性

3 讨 论

GDM合并妊娠期高血压是一种严重影响母婴健康的疾病，由此引起的肾功能损害是种严重影响孕妇及远期健康的一种并发症。故希望可以找到一种体现病情变化的小分子代谢物，可以早期发现及控制病情发展。代谢组学研究的是恰恰能够真实反映人体各系统的生理、病理状态,为临床诊治提供有力依据的小分子[5]。

LPC可以招募巨噬细胞参与吞噬，释放抗炎介质[6]，收缩血管[7]，促进平滑肌细胞的增殖，增加血管剪应力][8]，损害血管皮组织的连续性，促进血管炎症反应，影响了血小板聚集及血栓形成[9]。LPC这些作用与妊娠期高血压目前发病机制具有一致性，妊娠期高血压是一种代谢性疾病，LPC可能参与了妊娠期高血压的发生和发展，高血压是肾损伤的主要因素，故LPC有可能作为肾损伤的代谢指标。YEA等[10]利用色谱质谱联合的方法发现LPC可调节血糖水平。本研究发现，血清LPC18:0水平与HOMA-IR呈负相关，血清LPC18:0可能参与血糖的调节。有学者用LC-MS/MS验证出尿二棕榈酰磷脂酰胆碱是肾功能损伤的一种敏感标志物[11]。LPC由白蛋白转变为极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白,这种作用不依赖于高脂血症,LPC增高可能是肾病低蛋白血症患者心血管疾病不成比例增加的重要因素[12]。本研究显示，血清LPC18:0水平在GDM孕妇中水平升高，在GDM合并妊娠期高血压孕妇水平更高，说明LPC18:0在GDM合并妊娠期高血压孕妇体内代谢更加活跃，并且与肾功能损伤指标BUN、Cr、UmA1b、ACR均有一定的相关性，故血清LPC18:0可能是妊娠期高血压合并GDM肾功能损伤的监测指标。GDM与妊娠期高血压均为代谢性疾病，GDM孕妇容易出现妊娠期高血压，研究发现LPC18:0≥110 μg/mL组与LPC18:0<110 μg/mL组UmA1b、ACR水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，故LPC18:0水平有可能通过一些代谢通路影响肾脏疾病的发生和发展。根据上述研究，可能在子治疗时通过改变这些溶血性磷脂的含量，改善肾脏功能，从而可能预防或者延缓改善患者的症状。

综上所述，代谢组学研究的是人体最终的代谢产物，能真实反映人体的代谢状态，代谢物稳定，LC-MS/MS技术严谨、准确，可更好地应用于临床；考虑样本量小，还需进一步扩大样本量及监测范围。随着研究的进展，联合不同代谢物及其通路相关研究方法对妊娠期糖尿病及妊娠期高血压进行研究，可更好地发挥其临床应用价值。