清肺解毒丸的提取工艺研究

康绍建 王 飘 朱志坤 郭媛媛 陈凌云*

1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南省食品药品审核查验中心，云南 昆明 650011；3.云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500

清肺解毒丸由金银花、栀子、皂角刺等十七味中药组成，该方具有清热解毒、燥湿散结之功效。适用于肺胃湿热所致的痤疮、粉刺，症见颜面、胸背部丘疹样改变，或有脓疱、痒痛，伴有口渴、小便赤黄、便秘、舌红苔黄腻等症。方中君药金银花主要含有黄酮类化合物，具有抗炎和解热之功效[1]；栀子含有环烯醚萜类、有机酸、黄酮、香豆素等成分，现代药理研究[2]表明栀子具有抗炎、抗氧化、利胆、利尿、抗肿瘤、解热、镇痛等多种药理活性；皂角刺中含有黄酮、酚类、三萜等成分[3]，常用于治疗痈疽肿毒；白芷主要有效成分是香豆素类和挥发油，具有抗菌消炎、解热镇痛、止咳平喘等作用[4]；该方原为汤剂，乌梢蛇打粉冲服，处方中金银花、乌梢蛇、苍术等所含有效成分热不稳定或水溶性差，难以煎出和保留，因此拟将其开发成浓缩丸，使患者服用、携带方便。本文就制备工艺中的提取工艺进行了研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Diamonsil C18色谱柱[迪马科技(天津)有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm]；SK2200HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)；T-1000型电子天平(美国双杰兄弟有限公司)；真空干燥箱(苏州江东 DZF-6020)。

1.2 试药 栀子苷对照品(批号：110749-201919，纯度97.6%)购至中国食品药品检定研究院。皂角刺、栀子等所用饮片均由昆明市中医医院提供，经四川千方中药股份有限公司鉴定与检验合格。水为娃哈哈纯净水，色谱甲醇(德国Merck公司)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 因素水平的确定 实验在预实验以及查阅文献的基础上，选择加水倍数(A)、提取时间(B)和提取次数(C)3个因素，各因素取3个水平，以L9(34)正交试验表安排实验，以干膏得率和栀子苷转移率综合评分为指标进行考察，并对其进行方差分析，考察各因素对实验的影响程度大小，最终确定各参数的水平，筛选出最佳提取工艺条件[5]。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.2 干膏得率 称取1/8倍处方量的饮片共 23 g，置于圆底烧瓶中，按表1正交试验表进行回流提取，滤液转移至 1000 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，精密移取 50 mL 至已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于 105 ℃ 干燥 3 h，取出，置干燥器中冷却 0.5 h 后迅速称定其质量，计算干膏得率(干膏得率=干浸膏量×20/生药量)[6]。

2.3 栀子苷转移率[7]

2.3.1 色谱条件 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱；乙腈-水(8∶92)为流动相；检测波长 238 nm；进样体积 10 μL；流速 1 mL/min；柱温 25 ℃；理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于2000。

2.3.2 对照品溶液制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释成质量浓度为 248.8 μg·mL-1的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 称取1/8倍处方量的饮片共 23 g，进行回流提取，滤过，合并提取液，加蒸馏水定容至 1 000 mL，摇匀，精密移取 20 mL，加水饱和正丁醇振摇提取3次，每次 20 mL，合并正丁醇层，水浴挥至近干，残渣加甲醇溶解，定容至 5 mL，即得。

2.3.4 阴性对照溶液制备 按照处方比例称取除栀子以外的其余饮片，同供试品溶液制备方法制得缺栀子的阴性对照溶液。

2.3.5 专属性考察 取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，如图1，结果表明专属性良好。

2.3.6 线性与范围 分别精密移取对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，至 10 mL 容量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列梯度浓度的溶液，按上述色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标，栀子苷浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程:Y=12.532X-11.536(r=0.9998)，结果表明栀子苷对照品含量在24.88～248.8 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.7 仪器精密度 取对照品溶液，重复进样6次，结果栀子苷峰面积的RSD值为0.95%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.8 重复性 从同一份提取液中，取6份样品，每份 20 mL，分别制成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算栀子苷含量的RSD值为1.01%(n=6)，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.9 稳定性 取上述供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，栀子苷峰面积的RSD值为1.58%(n=6)，结果表明，供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.3.10 准确度 精密量取已知含量的提取液(91.25 μg·mL-1)6份，每份 5 mL，分别加入 1.5 mL 已知浓度的栀子苷对照品溶液(248.8 μg·mL-1)，按供试品溶液制备方法进行制备，进样，计算栀子苷含量和回收率。栀子苷的平均回收率为98.71%，RSD为2.53%，结果表明该方法准确度良好。

2.3.11 饮片含量测定 取栀子饮片3份，按《中国药典》2020年版一部栀子“含量测定”项下方法分别进行测定，计算含量，结果得栀子苷平均含量为2.16%，符合药典标准。

2.4 正交试验安排与结果 按表1所设计因素水平表和表2正交表，依次进行提取，测定各试验的干膏得率、栀子苷转移率。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交实验结果

表3 综合评分方差分析

综合评分[8]：栀子苷转移率及干膏得率权重系数分别为70%和30%，以得出的综合评分作为指标。综合评分=(栀子苷转移率/栀子苷最大转移率×0.7+干膏得率/干膏得率最大值×0.3)×100。

根据表2正交试验结果和表3综合评分方差分析结果可知，加水倍数(A)和提取次数(C)对综合评分的影响具有显著性意义，3个因素影响从大到小排序为提取次数、加水倍数、提取时间，按综合评分表中最高值优选出最佳提取工艺为A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮 1.5 h 。

2.5 工艺验证 为保证工艺的合理可行，对优选出的提取工艺进行验证。取处方量饮片3份，按A2B2C3条件提取，分别测定其干膏得率及栀子苷转移率，验证试验结果见表4。结果显示干膏得率和栀子苷转移率平均值均接近正交试验中最佳提取工艺结果，表明此方法具重现性，可作为最佳提取工艺条件。

表4 验证试验结果

3 讨论

清热解毒方由金银花、栀子、皂角刺等十七味药组成，该方原为汤剂，乌梢蛇打粉冲服，其余药味以水煎煮。为使患者服用、携带方便，本研究拟开发其新剂型，若改为液体制剂或颗粒剂，乌梢蛇有效成分难以煎出，且乌梢蛇气腥，煎煮难以掩盖其气味，若制成片剂或硬胶囊，因处方量较大，则每次服用片数或粒数过多，因此选择将其开发为丸剂(浓缩丸)，水溶性差和热不稳定成分可打粉入药，含有水溶性成分的药采用水提，能较好保留原料药有效成分，更好发挥药效，浓缩丸表面打光还可掩盖乌梢蛇的特殊气味，便于服用。

经查阅文献可知，本方中金银花、乌梢蛇、白芷、浙贝母、苍术、连翘中含有游离黄酮类、萜类、苯丙素类、香豆素类、生物碱类等难溶于水的成分[1-4,8-10]，因此以上六味采用打粉入药。其余皂角刺、紫花地丁等适宜煎煮的饮片采用水提，能较好保留原料药有效成分，更好发挥药效。方中君药皂角刺含有黄酮类、酚类、三萜类、香豆素类等成分[3]。在2020版中国药典中，未记载其含量测定方法；紫花地丁主要有效成分是秦皮乙素，含量测定的相关文献报道并不多；栀子的主要成分为栀子苷，是环烯醚萜苷类物质，易溶于水，受其他成分干扰小，易于测定，故选用栀子苷转移率作为指标来考察提取工艺。

此次试验利用HPLC法对栀子苷进行测定，从HPLC图可看出，栀子苷的分离度高，无杂质峰干扰，专属性强，该条件下测定结果的准确性、精密度、重复性较为良好，可作为其理想测定方法，为以栀子苷含量为指标的测定方法提供了参考依据。

正交试验具有科学性高、步骤简单、节省时间等优点，在中药提取工艺优化设计中被广泛应用[11]，本实验采用多指标信息熵权重分析法，结合正交设计优化提取工艺，以加水倍数、提取时间、提取次数作为考察因素，以干膏得率和栀子苷转移率为指标。根据试验结果表明，提取次数对综合评分影响最大，其次是加水倍数、提取时间。综合干膏得率和栀子苷转移率评价指标，得出其最佳提取工艺为煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮 1.5 h。