同位素内标稀释-超高效液相色谱串联质谱法 测定花生及其制品中黄曲霉毒素B1的含量

◎ 刘定舟，张丹鹤，周莹莹，李 超，赵雪峰，聂阿真，贾松涛，赵林萍

（1.河南中标检测服务有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州中道生物技术有限公司，河南 郑州 450001）

在目前已知的化学物质中，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的致癌性较强。在国家质检总局规定的必检项目中，AFB1也是大部分食品需要检测的项目。AFB1对人类和各种动物都有剧毒，其毒性主要损害肝脏[1]。由于花生高亲和性的原因，在花生的种收和加工过程中更易受到黄曲霉和黄曲霉毒素的污染。花生中产生的黄曲霉毒素有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1等，其中AFB1是其中毒性最强以及产毒量最大的毒素[2-3]。

目前来说，AFB1的主要检测方法有液相法、液质法、酶联免疫法等。通常，黄曲霉毒素在组织里的含量比较低，相比高效色谱法来说，液相色谱串联质谱法的灵敏度和准确性更高。而在液相色谱串联质谱法中，前处理方法常用的有免疫亲和柱净化法，固相萃取法和QuEChERS法等，这些方法互有优劣，但均存在步骤烦琐、回收率较低，基质效应残留影响定性、成本较高等问题[4-5]。本文目的在于建立同位素内标稀释-超高效液相色谱串联质谱法对市场常见花生及其制品里AFB1含量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品为花生、油炸花生、水煮花生、烤花生等；TSQ Vantage超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（Thermo Fisher Technologies）；天平，十万分之一；超声波清洗器；多管涡旋振荡器；色谱级甲醇、甲酸、乙腈；超纯水；AFB1对照品（批号Lot：1I0E17，纯度＞99%，Pribolab）；13C17-AFB1同位素内标对照品（批号Lot：2A00I13，0.504 μg·mL-1，Pribolab）；0.22 μm微孔及0.45 μm微孔有机相滤膜，津腾。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备净化过程

用高速粉碎机粉碎，称取5 g样品（精确至0.01 g），加入20 mL甲醇-水（70∶30，体积比），涡旋振荡10 min，用超声清洗器在40 ℃下超声20 min，于离心机中8 000 r·min-1冷冻离心5 min，取上清液经微孔滤膜过滤至10 mL离心管中，准确移取1 000 μL滤液，向其中加入13C17黄曲霉毒素B1同位素内标标准中间工作液（100 ng·mL-1）30 μL，用甲醇-水（70∶30，体积比）定容至10 mL，振摇均匀，备用。如果样液中AFB1含量超出了标准曲线的范围，则另做稀释，增加加入的内标量，使其上机浓度保持在0.3 ng·mL-1。

1.2.2 制备对照品溶液

①AFB1标准储备液（100 μg·mL-1）。准确称取AFB1标准品1.01 mg（精确至0.01 mg）至容量瓶中，加入乙腈，定容到10 mL，-18 ℃条件保存。②AFB1标准中间工作液（100 ng·mL-1）。准确移取0.1 mL AFB1标准储备液，置于容量瓶中，加入乙腈，定容到100 mL，-18 ℃条件保存。③13C17-AFB1同位素内标标准中间工作液（100 ng·mL-1）。移取200 μg13C17-AFB1标准储备液到1 mL的容量瓶里，用乙腈定容，-18 ℃条件保存。④AFB1标准曲线工作液。分别吸取AFB1标准中间液（100 ng·mL-1）0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL于10.00 mL容量瓶中向其中分别加入0.03 mL13C17-AFB1同位素内标标准中间工作液（100 ng·mL-1）用甲醇-水（70∶30，体积比）定容，得到AFB1浓度分别为0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1，内标浓度为0.3 ng·mL-1，临用新配。

1.2.3 检测

（1）仪器条件。色谱条件：色谱柱为waters ACQUITY UPLC BEH C18，粒径1.7 μm，2.1 mm×50 mm；流动相采用乙腈+0.1%甲酸水溶液；0.25 mL·min-1流速；25℃柱温、2 μL进样量。质谱条件采用电喷雾离子源、350 ℃、正离子扫描、多反应监测（SRM）监测方式。

（2）标准曲线的制作。依次把标准系列工作液注入液相，测定峰面积，以浓度为横坐标，以AFB1和13C17-AFB1峰面积比值为纵坐标，得到相应的标准曲线。

（3）试样溶液的测定。将试液注入液相之后，以保留出峰时间作为定性，以离子丰度比来确认定性，在标准曲线中代入AFB1和13C17-AFB1的峰面积比值，得出定量。

2 结果与分析

2.1 质谱优化

将试液直接注入质谱，切换离子条件，优化得知响应度最好的为正离子模式，在此模式下再对AFB1及13C17-AFB1的母离子与子离子进行优化选取，分别得到1个母离子与3个最优的子离子，以及对应的离子条件（表1）和离子流图（图1、2）。

表1 质谱监测条件表

2.2 线性范围及限量

分别配制试液浓度0.001 ng·mL-1、0.005 ng·mL-1、0.010 ng·mL-1、0.050 ng·mL-1、0.100 ng·mL-1、0.500 ng·mL-1、1.000 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1、10.000 ng·mL-1、50.000 ng·mL-1、100.000 ng·mL-1和500.000 ng·mL-1的AFB1标准溶液，通过以上质谱条件测定后，绘制浓度比峰面积的曲线。结果表明浓度范围为0.010～100.000 ng·mL-1时线性拟合度较好，线性方程Y=2.648e-1X，相关系数（r2）=0.999 6，以SN＞3和SN＞10时的浓度分别对应检出限和定量限，本法AFB1的检出限和定量限分别为0.03 ng·mL-1和0.10 ng·mL-1（以1 g样品定容体积为100 mL计）。

2.3 回收率及重复性

在花生、油炸花生、水煮花生、烤花生中添加13C17-AFB1标准物质，质控浓度溶液分别为0.1 ng·mL-1、0.3 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1，进行10次平行实验，计算结果见表2，从表2可以看出，以上待测物回收率均大于86.4%，精密度均小于10.0%。

表2 AFB1回收率和精密度表

2.4 实际样品的检测

采用本方法对402份市场售卖花生及其制品（花生、油炸花生、水煮花生、烤花生）进行AFB1含量的测定，其中110份有检出，62份超过国家限量标准20 μg·kg-1，含量在0.2～1 000.0 ng·mL-1不等，这从一方面反映了市售花生及其制品中AFB1污染率较高，对食用花生及其制品的群体来说存在隐患。

2.5 特殊样品的举例

霉变的花生并非一定含有AFB1。客户送检过两份生花生样品，样品1中小部分花生胚部有肉眼可见的黑色霉斑，经连续3次检测后，未检测到AFB1残留；样品2无可见霉斑，物理性状无异常，经连续3次检测后，AFB1均检出超出国家限量标准20 μg·kg-1，平均值为232 μg·kg-1。

3 结论

基于液相色谱串联质谱同位素内标法所建立的花生及其制品中AFB1的快速定性定量分析方法，采用稀释的手段来降低基质干扰，结合同位素内标来校正基质效应，减少了上柱净化、氮吹复溶等步骤，避免了免疫亲和柱等对目标物造成的损失，简化了实验步骤，提高了实验效率，降低了实验成本，简单易行，分析时间短，灵敏度高，重复性好，可满足日常检测需求，也对痕量样品的分析适用。