液相色谱质谱联用仪测定动物源性食品中 21种杀菌剂残留量的方法研究

◎ 汤苗苗，郭良起，张晓莉，孙 晶，侯 赛

（河南广电计量检测有限公司，河南 郑州 450000）

杀菌剂一般是指用于防治由各种病原微生物引起植物病害的农药。随着现代杀菌剂的开发和大规模应用，病害对杀菌剂的抗性越来越强，病害的抗性发展要求必须不断开发杀菌活力更强，杀菌谱更广的杀菌剂，杀菌剂已成为近年来农药研发的热点之一。而随着杀菌剂的开发及使用，其残留物可随着饲料的消耗转移至动物组织中，继而可能存在于生乳、动物肌肉等动物源产品中，最终通过食物链对人类产生危害。为此，有必要针对动物源性食品中杀菌剂残留检测方法进行深入研究，对其残留量进行监测，以确保消费者的身体健康。

目前，对杀菌剂的研究多为植物源食品及土壤、水体中的残留，针对动物源食品中各类杀菌剂的残留研究较少，且对杀菌剂残留研究也多为常规农药（有机磷、有机氯及拟除虫菊酯等）[1-6]。针对目前研发及使用率较高的杀菌剂，如酰胺类杀菌剂（苯并烯氟菌唑、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺和氟吡菌胺）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（吡唑醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯）等杀菌剂在动物源性食品中均未见系统研究。本研究采用PSA+C18复合填料净化结合高效液相色谱 - 串联质谱（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)建立了同时检测动物源性食品中21种杀菌剂的检测方法，可以为相关食品制定国家标准提供技术支持，同时为国家监管相应动物源性食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：从超市/农贸市场购买的牛肉、生牛乳及乳粉，将牛肉样品匀浆、生牛乳混匀后备用。

试剂：QuEChERS分散萃取填料为安捷伦科技有限公司生产；乙腈、甲醇、乙酸铵均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司生产。

21种标准物质：嘧霉胺、2-苯胺基-4,6-二甲基嘧啶-5-羟基（嘧霉胺-5-羟基）、嗪氨灵、丙硫菌唑、脱硫丙硫菌唑、苯醚甲环唑、苯醚甲环唑醇、三唑醇、三唑酮、苯菌酮、苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺、氟吡菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯、氟硅唑、丙环唑、吡噻菌胺、咪鲜胺和嘧菌环胺，天津阿尔塔科技有限公司生产。

仪器：Waters TQ-S micro高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪配电喷雾离子源（ESI），美国Waters公司；ME204E/02分析天平，上海梅特勒-拖利多仪器有限公司；CT14RDП台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；MnltiReax振荡器，德国Helidolph公司，AS系列超声波清洗仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Milli-Q Advantage A10纯水机，美国Merck Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准储备溶液配制

①混合标准储备溶液。取一定量的标准物质于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1.0 mg·L-1的混合标准储备液。②混合标准中间液。吸取混合标准储备液1.0 mL混合于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成0.1 μg·mL-1的混合标准溶液。③基质混合标准工作液。用空白基质溶液配制成0.5～20.0 μg·L-1的混合标准工作液，现用现配。

1.2.2 仪器条件

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC® BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱 温40 ℃；流 速：0.3 mL·min-1；进样量：10 μL；流动相A为2 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸），B为乙腈；洗脱程序：0～2 min，5%B；2～4 min，5%～100%B；4～7 min，100%B；7.0～7.1 min，100%～5%B；7.1～8.0 min，5%B。

质谱条件：电喷雾正离子模式；多反应监测模式（MRM）采集，毛细管电压2.80 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂气流量800 L·h-1。定性离子对、定量离子对、碰撞能量和锥孔电压见表1。

表1 21种化合物质谱检测参数表

续表1

1.2.3 样品前处理

（1）生牛乳、牛肉。①生牛乳样品，混合均匀；牛肉样品匀浆。②分别取5 g样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈、5 g氯化钠，涡旋振荡提取，离心分层，转移上清液，残留物用10 mL 0.2%甲酸乙腈重复提取，离心后合并上清液备用。

（2）乳粉。①取5 g于50 mL聚乙烯离心管中，加入5 mL水混匀浸泡30 min，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈、5 g氯化钠，涡旋振荡提取，离心分层，残留物用10 mL 0.2%甲酸乙腈重复提取，离心后合并上清液备用。②净化。取2.0 mL提取液于含100 mg C18和100 mg PSA的10 mL离心管中，涡旋1 min，离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.4 方法的准确度和精密度

取牛肉、生牛乳及乳粉5 g，分别添加10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、40 μg·kg-13个浓度水平，按“1.2.3”进行前处理操作，每个浓度进行3个样本分析，24 h内连续进样，并与标准曲线同时进行，计算24 h内精密度。

1.2.5 方法适用性

随机选取市场上生牛乳、纯牛奶、乳粉和牛肉各5份，按“1.2.3”进行前处理操作。

2 结果与分析

2.1 方法的准确度和精密度

由表2知，21种杀菌剂的回收率范围在70.0%～120.0%，精密度均小于10%，说明该方法准确、可靠、重现性好。

表2 方法的精密度和回收率表（n=6）

续表2

2.2 方法的适用性

采用本实验建立的方法测定了采集市场上生牛乳、纯牛奶、乳粉、牛肉各5份，均低于LOQ，检出率和超出率为0。

2.3 标准曲线和线性范围

在最低添加回收水平下，以3倍和10倍信噪比结合浓度外推法确定方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）。以满足方法学要求的最低添加浓度作为定量限，在0.5～20.0 μg·L-1线性关系良好，r＞0.995，方法检出限为0.7 μg·kg-1，方法定量限为2.0 μg·kg-1。满足《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）的要求。

2.4 样品提取剂选择及优化

本研究考察了乙腈、80%乙腈（含0.2%甲酸）、1%甲酸乙腈、0.1%甲酸乙腈和0.2%甲酸乙腈为提取液时对目标物的提取效率。通过加标回收法，在空白基质中加入有代表性的7种杀菌剂混合标准溶液，加标水平均为20 μg·kg-1，静置24 h后加入20 mL提取液，5种溶液在生牛乳、乳粉、牛肉的提取效率见图1～图3。由比对结果知，0.2%甲酸乙腈提取的回收率较高，因此选择0.2%甲酸乙腈作为提取溶剂。同时考虑乳粉直接用溶剂提取会出现结块现象，将奶粉用水浸泡溶解后提取，不再结块，且提取效果提高约20%。

2.5 净化方式的比较和选择

考虑动物源性食品中存在磷脂、蛋白质、脂肪干扰部分化合物分析定量，需要净化去除干扰。常用的PSA吸附剂为弱阴离子交换填料，能有效去除基质中糖类、脂肪酸等物质；C18吸附剂为硅胶基质键合十八烷基填料，具有比表面积大、吸附能力强等优点，能够较好除去脂类、脂肪等非极性物质的干扰。选择PSA、C18、PSA和C18复合、Oasis PRiME HLB柱净化，以监测磷脂信息比较净化效果，最终选择PSA+C18（1+1）复合净化方式。

2.6 基质效应的影响与校正

用不同的基质按照前处理方法净化后得到的上清液配制标准溶液为基质匹配标准溶液，用溶剂配制的标准溶液作为溶剂标准溶液，通过测定该21种杀菌剂在各基质匹配标准溶液中校正曲线的斜率（A）及其在纯溶剂标准溶液中校正曲线的斜率（B），得到基质效应（Matrix Effect，ME），ME=（A-B）/B×100%。根据文献[6-7]的研究，当-50%≤ME＜-20%或20%＜ME≤50%时，为中等程度的基质干扰效应；当ME＜-50%或ME＞50%，表示基质干扰程度强烈。

21种杀菌剂基质效应如图4所示，结果表明，不同农药基质效应不同，同种农药在不同基质中基质效应也不同，大部分干扰为中等或者强烈程度，因此基质标准溶液定量非常重要。

3 结论

本项目建立了一种同时检测动物源性食品中21种杀菌剂的检测方法，该方法具有安全高效、快速准确、易实现自动化等特点，对目标化合物的加标回收率达到70%～120%，24 h内精密度和稳定性测试RSD≤10%，方法重现性高，且检出限能满足国家标准中对牛肉、生牛乳及乳粉中杀菌剂限量的最低要求。