基于HPLC-MS/MS的内标法测定灵芝孢子粉中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定

◎ 陈 云，吴妙姗，崔 平

（安徽工业大学 化学与化工学院，安徽 马鞍山 243000）

灵芝孢子粉是灵芝生长成熟后从菌盖弹射出的含有丰富的蛋白质、多糖、三萜、脂肪酸等成分的孢子，具有抗肿瘤细胞、降低血糖、抗氧化等功效[1]。长三角地区的地理环境和气候易使灵芝孢子粉在生长和储存过程中发生霉变，产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素主要有黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和伪溜曲霉4种曲霉菌产生的次生代谢物。现阶段可以分离鉴定出18种包括B1、B2、M1、M2、G1、G2、Q、P1、H1和GM等[2]，而其中黄曲霉B1是剧毒且最危险的致肝癌物质，常在粮食谷物、油、牛奶、饲料等中检出[3]。目前薄层色谱法[4]、酶联免疫吸附法[5]、高效液相法[6]、液相质谱联用法[7]及气相质谱联用法可作为黄曲霉毒素的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝孢子粉（安徽霍山）；黄曲霉毒素B1（AFB1）（2.01±0.05） ng·mL-1；黄曲霉毒素B1同位素内标（13C17-AFB1）（0.501 ng·mL-1），甲醇、乙腈和甲酸铵（色谱纯）。

1.2 仪器与设备

Agilent 6460型串联三重四极杆质谱仪（美国安捷伦）；N-EVAPTM111型氮吹仪（美国Organomation）；CQ-300B-S超声清洗机（上海跃进器械）；HC-3018R高速离心机（安徽中科）；MS3 digitial涡旋混匀器（德国IKA）；AL204型电子天平（赛多利斯）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准系列溶液配制

AFB1标准品取0.2 mL至10 mL容量瓶中用乙腈定容，配制标准工作液（100 ng·mL-1），然后精确量取50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、600 μL至10 mL容量瓶中，加入100 μL同位素内标液，用初始流动相定容至刻度，配制浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、3.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1，内标浓度均为5.0 ng·mL-1的系列标准溶液。

1.3.2 待测样品制备

在50 mL离心管中称样5 g，加入0.1 mL同位素内标液混匀，加入20.0 mL 90%乙腈溶液，超声5 min，5 000 r·min-1转速离心3 min，取4.0 mL上液，加入蒸馏水20 mL，过免疫亲和柱净化，乙腈洗脱，收集净化液45 ℃氮吹近干，用流动相定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜上机待测。

1.3.3 数学模型确定

根据同位素内标法曲线推算AFB1浓度，计算如下式：

式中：X为试样中AFB1的含量，μg·kg-1；ρ为样品溶液在同位素内标曲线中浓度，ng·mL-1；V1为试样提取体积，mL；V3为净化后最终体积，mL；1 000为换算系数；V2为净化时取样体积，mL；m为称样量，g。

1.3.4 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱为Aglient SB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相A：5 mmol·L-1甲酸铵水溶液，流动相B：乙腈-甲醇溶液（1∶1），流动相比例为40∶60；流速：0.25 mL·min-1；柱温：35 ℃。

（2）质谱条件。方式：多反应检测MRM；离子源：电喷雾ESI；干燥器温度：300 ℃；干燥气流量：11 L·min-1；雾化器压力：15 psi；扫描方式：正离子，各目标物参数见表1。

表1 质谱离子参数表

2 结果与分析

以AFB1与13C17-AFB1色谱峰面积比为纵坐标，AFB1与13C17-AFB1质量浓度比为横坐标进行拟合，拟合后回归方程为Y=1.967 766X+0.002 994，相关系数R2为0.995 3。分析了7份灵芝孢子粉阳性样品，可计算出7份样品中AFB1含量分别为2.83 μg·kg-1、2.82 μg·kg-1、2.86 μg·kg-1、2.84 μg·kg-1、2.81 μg·kg-1、2.83 μg·kg-1及2.84 μg·kg-1，均值为2.83 μg·kg-1，相对标准偏差为0.56%。

3 不确定度来源确定

根据试验的数学模型分析，AFB1的同位素内标法测量结果产生的不确定度主要由称取样品质量、样品处理过程、标准溶液浓度、测量重复性、工作曲线和分析仪器本身6方面组成。

3.1 称取样品质量产生的不确定度分量

用电子天平称量样品，称样量引入的不确定度m=5.000 0 g，天平误差±0.000 1 g，则

3.2 样品处理引入的不确定度

样品加入内标物0.1 mL，定容总体积为20 mL，吸取4 mL上清液净化后定容至1 mL。根据《实验室玻璃仪器 单标线吸量管》（GB/T 12808—2015）和《实验室玻璃仪器 分度吸量管》（GB/T 12807—1991）规定：过程中使用20 mL和1 mL单标吸量管，1 mL和5 mL分度吸量管的允许差分别为±0.030 mL、±0.007 mL、±0.008 mL和±0.025 mL，其相对标准不确定度分别为：

则样品处理过程中引入的相对标准不确定度可合成为：

3.3 标准溶液浓度的不确定度

3.3.1 标准物质引入的不确定度

使用AFB1浓度是（2.01±0.05） ng·mL-1，提供的不确定度包含因子则相对标准不确定度为

3.3.2 标准溶液配制引入的不确定度

用1 mL分度吸量管移取0.5 mL的AFB1标准物质于10 mL容量瓶（A级）中，得到100 ng·mL-1的AFB1标准工作液。设所有操作过程中温度一致，体积微量变化不计入，1.0 mL分度吸量管urel(V11)=0.004 6，10 mL容量瓶在《实验室玻璃仪器 单标线容量瓶》（GB/T 12806—2011）中允许差为±0.020 mL，按三角分布处理：

稀释重复性容量瓶为0.10 mL，按均匀分布计算：

相对标准不确定度合成为：

3.3.3 分取标准溶液体积不确定度。

配制系列标准溶液时用1 mL A级分度吸量管分取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.60 mL AFB1储备液于10 mL A级容量瓶，再各自加入0.1 mL内标液，定容。其中1 mL的A级分度吸量管使用12次，10 mL A级容量瓶使用6次。因此，系列标准溶液的不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.4 测量重复性的不确定度

同一条件下，对同一样品重复测定7次，结果如表3。

表2 测量结果表

表3 测量结果表

根据分析结果，可计算得样品AFB1浓度和数据列的标准差s：

则标准和相对标准不确定度计算为：

3.5 工作曲线的变动性分量

拟合后的AFB1标准溶液数据结果表4所示。

线性方程为：Y=1.967 766X+0.002 994，拟合标准曲线残余标准偏差：

按照下式计算工作曲线的不确定度：

每份样品和工作曲线溶液各测量1次。

样品浓度为2.83 ng·mL-1，内标物浓度为5.0 ng·mL-1，故相对标准不确定度为：

3.6 分析仪器的不确定度

操作过程中已包括样品重复测定和标曲的线性拟合，故检测分析仪器不再计算不确定度。

3.7 合成不确定度

合成相对标准不确定度为：

则标准不确定度为：

4 扩展不确定度评定

样品中AFB1的含量为2.83 μg·kg-1，在置信水平95%时，取包含因子k=2，U=0.13×2=0.26 μg·kg-1。灵芝孢子粉中AFB1的含量结果表示为（2.83±0.26）μg·kg-1，k=2。

5 结论

本实验建立了液相色谱-串联质谱内标法测定灵芝孢子粉中黄曲霉毒素B1含量的检测方法，从称取样品质量、样品处理过程、标准溶液浓度、测量重复性、工作曲线及分析仪器本身6方面不确定度的评定发现影响结果的主要因素为标准溶液的配制和标准曲线拟合，因此可通过选择更加精密的计量器具，增加标准溶液的浓度点及提升操作人员的能力水平等方法来降低不确定度，提高结果的准确性。