民猪与大白猪背最长肌能量代谢关键酶活性研究

2022-08-13李忠秋刘春龙吴赛辉张冬杰王文涛何鑫淼亓美玉何海娟

中国畜牧杂志 2022年8期

李忠秋，刘春龙，吴赛辉，张冬杰，王文涛，何鑫淼，田明，亓美玉，何海娟，刘娣*

（1.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，农业农村部种养结合重点实验室，黑龙江哈尔滨 150086；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨 150081）

肌纤维是骨骼肌的基本结构单位，肌纤维类型的不同具有不同的代谢特征，根据肌纤维中肌球蛋白重链（Myosin Hevay Chain，MyHC）亚型的不同，将肌纤维分为MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIx 和MyHC IIb 4种类型，I 型属于慢速氧化型，IIa 型属于快速氧化型，IIb 型属于快速酵解型，IIx 型属于中间型，代谢特征介于IIa 型和IIb 型之间，氧化代谢能力按照I 型、IIa型、IIx 型、IIb 型依次降低型。骨骼肌能量代谢主要包括有氧代谢和无氧酵解，琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）和苹果酸脱氢酶（Malate Dehy drogenase，MDH）可代表肌肉的氧化代谢能力，乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的活性可反映细胞内糖酵解的水平。研究发现，耐力训练的运动员肌肉中慢型肌含量增多，SDH 活性显著提高；在测定大鼠膈肌中不同种肌纤维类型SDH 的活性时发现，SDH 活性在I 型和IIa 型肌纤维中较高；在检测人骨骼肌纤维SDH 活性时，发现SDH 活性在I 型最高，IIa型次之，IIb 型活性最低。在检测兔膈肌肌纤维亚型和代谢酶活性时，发现MDH 活性增强与增加兔膈肌I型肌球蛋白的表达一致。在研究不同牛种肌纤维类型与酶活性差异时，发现MDH 活性与I 型肌纤维比例呈正相关。在比较研究豚鼠的各种肌肉中LDH 的活性时发现，比目鱼肌（I 型纤维含量较多）LDH 活性最低，白半膜肌和白股肌（IIb 型纤维含量较多）LDH 活性最高，红股肌（IIa 型纤维含量较多）LDH 活性居中。

我国地方猪种的肌纤维类型组成与引进商品猪种的肌纤维类型组成相比，地方猪种氧化型纤维含量较高，而酵解型纤维含量较低，如莱芜猪与杜洛克猪相比，莱芜猪氧化型纤维含量显著高于杜洛克猪；成华猪、巴马香猪、梅山猪、金华猪、二花脸猪与大白猪相比，其氧化型纤维含量均显著高于大白猪。民猪是我国优秀的地方品种，具有地方猪品种的优良特性，氧化型纤维含量较高；大白猪是典型的引进品种，酵解型纤维含量较高，而民猪与大白猪能量代谢关键酶活性的研究较少，本实验在检测民猪和大白猪肌纤维类型组成差异的基础上，采用比色法对民猪和大白猪骨骼肌能量代谢关键酶类活性进行研究，从骨骼肌能量代谢水平分析民猪和大白猪肌纤维类型组成差异的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料在黑龙江省农业科学院畜牧研究所民猪养殖基地，选择民猪和大白猪各6 头，体重95 kg 左右，公母各半，公猪已阉割。屠宰前，禁食24 h，不禁水。屠宰后迅速取1 g 左右背最长肌样品（在第13、14 肋间），放入冻存管，投入液氮，带回实验室，-80℃保存备用，用于肌纤维类型和酶活性检测。

1.2 实验方法

1.2.1 肌纤维类型组成测定

1.2.1.1 总RNA 的提取和cDNA 合成总RNA 的提取按照TRLzol（AMBION）说明进行，总RNA 的完整性检测使用琼脂糖凝胶电泳法，总RNA OD 值测定应用分光光度计法，总RNA 浓度通过计算调整为1 µg/µL，分装，储存于-80℃冰箱中备用。

cDNA 合成按照cDNA 合成试剂盒（All-in-one First Strand cDNA Synthesis Kit,SEVEN）说明书要求进行。合成体系为20 µL：RNA 6 µL、5×Master Mix 4 µL、DEPC-ddHO 10 µL。反应条件为42℃15 min，短暂离心，冰上冷却，-20℃冰箱保存。

1.2.1.2 引物的设计和合成参照Park 等设计合成和引物用于荧光定量PCR，内参为，引物序列及扩增片段长度见表1。

表1 引物信息

1.2.1.3 荧光定量PCR 按照荧光定量PCR 试剂盒（2×SYBR Green qPCR MasterMix,SEVEN）进行荧光定量反应，反应体系20 µL：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 µL，上下游引物（0.25 µmol/L）各0.5 µL，cDNA（0.2 µmol/L）0.5 µL，ddHO 8.5 µL。反应程序为：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，40 个循环；每个样品3 个重复。以内参基因进行校正，目的基因的相对表达量采用2的方法来计算。

1.2.2 能量代谢关键酶类活性测定

1.2.2.1 蛋白定量测定按照蛋白浓度测定试剂盒（南京建成蛋白定量试剂盒）说明书进行样品蛋白浓度测定。按照操作表2 进行操作。计算公式：待测样本蛋白浓度（g/L）=（测定OD 值-空白OD 值）/标准OD 值-空白OD 值）×标准品浓度（0.563 g/L）。

表2 操作表格

1.2.2.2 SDH 测定按照南京建成琥珀酸脱氢酶（SDH）测试盒说明进行样品中SDH 活性检测。计算公式为：SDH 活性（U/mgprot）=（ΔA 值÷0.01/ 反应时间（1 min））/（取样量（0.1 mL）× 待测样本蛋白浓度（mgprot/mL））。

1.2.2.3 MDH 测定按照南京建成苹果酸脱氢酶（MDH）测试盒说明进行样品中MDH 活性检测。计算公式为：MDH 活性（U/mgprot）=（测定ΔA-空白ΔA）/6.2*×比色光径（0.5 cm））×（反映液总体积（1.05 mL）/取样量（0.05 mL））× 样本测试前稀释稀释÷ 待测样本蛋白浓度（mgprot/mL），其中，6.2*为底物的微摩尔消光系数。

1.2.2.4 LDH 测定按照南京建成乳酸脱氢酶（LDH）测试盒说明进行样品中LDH 活性检测。按照操作表3 进行操作。计算公式为：LDH 活性（U/gprot）=（测定OD 值-对照OD 值）/（标准OD 值-空白OD 纸）× 标准品浓度（2 mmol/L）÷ 匀浆蛋白浓度（gprot/mL）。

表3 操作表格

1.3 数据分析实验中获得的数据应用SPSSV 17.0 软件的One-Way ANOVA 或T-Test 进行计算和统计分析，结果均采用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 肌纤维类型组成测定结果民猪和大白猪4 种肌球蛋白重链检测情况见图1。民猪I 型、IIa 型和IIx 型mRNA 表达量均显著高于大白猪，分别是大白猪的1.56、1.73、1.63 倍；而IIb 型mRNA 表达量显著低于大白猪，是大白猪的0.4 倍。结果表明，民猪氧化型和中间型纤维含量高于大白猪，而酵解型纤维含量低于大白猪。

图1 民猪和大白猪MyHC 亚型mRNA 表达差异

2.2 民猪与大白猪能量代谢关键酶活性测定结果民猪与大白猪SDH、MDH 和LDH 酶活情况见图2，民猪SDH 和MDH 活性显著高于大白猪，分别是大白猪的1.33 倍和1.21 倍；LDH 活性显著低于大白猪，是大白猪的0.88 倍。结果表明，民猪有氧代谢关键酶活性高于大白猪，无氧代谢关键酶活性低于大白猪。

图2 民猪与大白猪SDH、MDH 和LDH 活性差异

3 讨论

骨骼肌承载着收缩运动、能量转化、物质代谢、结构支撑等核心作用。骨骼肌占哺乳类动物机体组成的40%～50%，并调节全身的能量代谢稳态。在同一条件下，肌肉处于何种代谢类型与肌肉的自身状况密切相关，肌肉代谢需要各种酶的参与，代谢酶活性的高低直接影响肌肉代谢状况，肌肉中的SDH、MDH 和LDH活性能在一定程度上反映肌肉代谢特征。SDH 和MDH 可代表肌肉的氧化代谢能力，LDH 的活性可反映细胞内无氧糖酵解的水平。肌纤维类型组成影响骨骼肌的能量代谢，与相关代谢酶活性密切相关，I 型具有较高的氧化代谢能力，糖酵解能力较低，其代谢酶中的SDH 和MDH 活性较高。IIb 型糖酵解能力高，糖酵解酶LDH 活性很高，有氧代谢酶活性低。IIx 型代谢特征与IIb 型接近，但氧化代谢程度高于IIb 型。IIa 型代谢特征介于IIx 和I 型之间。在牛肉中，SDH 和MDH活性与肌纤维直径负相关，MDH 活性与I 型含量呈正相关，LDH 活性与IIb 型含量呈正相关，并与牛肉的肉质性状息息相关，SDH、MDH 活性与屠宰后24 h肌肉pH（pH）显著正相关，MDH 活性对肌内脂肪沉积具有积极作用，LDH 活性与pH呈显著负相关，LDH 活性更高时其pH更低，表明LDH 活性与牛肉的酵解能力呈正相关。在猪肉中，氧化型肌纤维表达量高的猪肉其MDH 活性也高，MDH 活性与其肌内脂肪含量具有相关性，MDH mRNA 基因表达与猪肉中肌内脂肪含量关系密切，提高仔猪猪肉MDH 活性可提高其肌内脂肪的沉积，在肌内脂肪含量较高的猪肉中MDH 活性显著高于肌内脂肪低的猪肉，在猪背最长肌中LDH 活性越高时pH越低，SDH 活性更高时其pH也更高。民猪是典型的脂肪型猪种，肌内脂肪含量高达5.39%，显著高于大白猪，背最长肌pH为5.63，显著高于长白猪。猪肉中肌内脂肪含量主要由肌纤维类型组成决定，I 型与肌内脂肪含量呈正相关，IIb 型与肌内脂肪含量呈负相关；肌肉中IIb型含量直接影响屠宰后猪肉中pH 值下降的速度，IIb型含量越高，pH 值下降越快，pH越低，影响猪肉的品质，甚至产生PSE 肉。本研究中民猪氧化型纤维I 型和IIa 型含量显著高于大白猪，酵解型纤维IIb 型含量显著低于大白猪，氧化代谢酶SDH 和MDH 活性显著高于大白猪，糖酵解酶LDH 活性显著低于大白猪。民猪背最长肌中较高的有氧代谢关键酶活性高可能与氧化型肌纤维含量高有关。