高效液相色谱法同时测定牛奶中阿苯达唑、氟苯达唑、噻苯达唑及4种代谢物残留量

2022-08-12赵雪宁雷浩贺习文高勤叶李易轩

中国奶牛 2022年7期

赵雪宁，雷浩，贺习文，高勤叶，李易轩

（陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，渭南 714000）

阿苯达唑、氟苯达唑和噻苯达唑同属于苯并咪唑类药物。苯并咪唑类药物是含有2个氮原子的芳香杂环，以苯并咪唑环构筑的药物分子，具有广泛的生物活性，可作为组胺受体拮抗剂、抗高血压药、广谱驱虫类药、抗真菌药物、抗病毒类药物等。阿苯达唑、氟苯达唑和噻苯达唑均作为广谱驱肠虫类药物被广泛使用[1,2]。

苯并咪唑类药物虽然具有高效低毒的优点，但在实验动物和靶动物中有致畸和致突变的作用，且在动物体内转化的代谢物具有毒理性，所以在动物源性食品中是重点监控的对象[3,4]。目前有关苯并咪唑类药物检测方法的报道多见于动物组织[5]、动物血清和饲料等基质样品，测定乳制品的报道相对较少。汤娟等[6]利用高效液相色谱-串联质谱法测定了奶粉中3种苯并咪唑类药物残留，吴宇鹏等[7]利用UPLC-MS/MS法测定了牛奶中14种苯并咪唑类药物及部分代谢物残留，吴鹏等[8]研制了能测定噻苯咪唑的ELISA检测试剂盒。这些报道中大都使用液相色谱-串联质谱仪，检测成本较高，而ELISA虽然操作快捷简单，但通常仅能筛查一种化合物，具有较大的局限性。

目前，常用的苯并咪唑检测方法有高效液相色谱法[9～11]、ELISA法[8]、液相色谱-串联质谱法[12～17]。本研究采用经济实用，同时能够准确定性的高效液相色谱法，通过调整仪器条件和样品处理过程，建立了一种能同时测定牛奶中3种苯并咪唑类药物和4种代谢物的完整方法，该方法前处理快捷，检出限低，回收率高，稳定性良好，具有广泛使用的价值。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及材料

Ultimate 3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；H1850型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MS205DU型十万分之一天平（Mettler Toledo公司）；CP224C型万分之一天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；MX-S型涡旋混合仪（大龙兴创仪器（北京）股份有限公司）；KQ-100DB型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；MTN-4800A型氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

阿苯达唑（坛墨质检，纯度97.2%）；阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜（阿尔塔科技有限公司，纯度98.0%）；氟苯达唑、2-氨基氟苯达唑，噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑（Dr.Ehrenstorfer，纯度99.3%）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Sigma公司）；超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；盐酸（优级纯，西陇科学股份有限公司）；氨水（25%优级纯）、冰乙酸（分析纯）（天津市富宇精细化工有限公司）；2%乙酸溶液；10%盐酸溶液。

C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱，均为200mg/3mL（月旭科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：A相为甲醇，B相为2%乙酸溶液，0～10min 60%B，10～12min 60%B～30%B，12～17min 30%B，17～20min 30%B～60%B；流速：1.0mL/min；检测波长：292nm；进样量：10μL。

1.2.2 样品前处理过程

提取：准确称取5.00g牛奶试样，置于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈，涡旋混合1min，超声提取5min，8 000r/min离心3min，准确移取上清液5.00mL于10mL离心管中，40℃下氮气吹干，加入3mL 10%盐酸溶液复溶，待净化。

净化：取C18固相萃取小柱，依次用3mL甲醇、3mL水活化，将上述净化液全部转移至固相萃取小柱中，控制流速不超过1mL/min，待样液全部通过固相萃取小柱后，用3mL水淋洗，抽干，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，在40℃下氮气吹干，加入1mL甲醇复溶，过0.45μm滤膜后供高效液相色谱仪测定。

1.2.3 标准溶液的配制

标准贮备液的配制：准确称取阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、2-氨基氟苯达唑、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑标准物质各10mg，分别置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1mg/mL的6种化合物的标准贮备液；准确称取氟苯达唑标准物质10mg于10mL棕色容量瓶中，用10%盐酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1mg/mL的氟苯达唑标准贮备液。

标准混合中间液的配制：准确移取7种标准贮备液各1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100μg/mL的混合中间液。

2 结果与讨论

2.1 流动相的确定

试验过程中发现阿苯达唑和氟苯达唑保留时间较长，其余5种化合物保留时间较短，因此采用水相加有机相梯度洗脱的方式。

在水相的选择上，考察了20mmol/L乙酸铵溶液、2%乙酸溶液和0.1%磷酸溶液，其中乙酸铵溶液的洗脱时间最长，磷酸溶液的峰型尖锐，但2-氨基氟苯达唑和阿苯达唑砜难以分离，综合考察下，乙酸溶液的洗脱时间和分离效果最为理想。

在有机相的选择上，结合所使用的C18色谱柱，优先考虑甲醇和乙腈作为有机相。使用乙腈作为有机相时，5-羟基噻苯达唑保留时间过短，与溶剂倒峰相连，无法进行积分计算，同时在梯度洗脱时由于有机相比例变化，基线浮动明显；使用甲醇作为有机相时，5-羟基噻苯达唑保留时间明显后延，同时梯度洗脱时基线没有明显浮动，因此流动相选择2%乙酸溶液和甲醇梯度洗脱，7种化合物的标准溶液谱图和加标样品图谱见图1。

图1 7种化合物的标准溶液谱图和加标样品图谱

2.2 检测波长的确定

使用二极管阵列检测器对7种化合物进行全波长扫描，结果显示最大吸收波长集中在290～310nm之间，使用292nm时7种化合物峰高差距较小。

2.3 提取溶剂的确定

考虑阿苯达唑、氟苯达唑在丙酮和三氯甲烷等有机溶剂中不溶或微溶，因此提取溶剂考虑甲醇和乙腈两种有机试剂。经过试验验证，两种溶剂对除氟苯达唑外的6种化合物均有良好的提取效果。氟苯达唑在甲醇中溶解性差，回收效果低于乙腈。除此之外，乙腈能够沉淀牛奶样品中的蛋白，离心后相比甲醇提取更加澄清，有助于固相萃取柱的净化。

2.4 固相萃取柱的选择

试验考察了HLB、MCX和C18三种不同填料的固相萃取柱，3种固相萃取柱对7种化合物的回收效果见图2。

图2 不同填料固相萃取柱的回收效果

从图2可以看出，HLB填料和C18填料的固相萃取柱回收效果明显优于MCX填料固相萃取柱，C18固相萃取柱对氟苯达唑的回收效果优于HLB固相萃取柱，综合考虑，采用C18固相萃取柱作为净化材料。

2.5 方法学考察

2.5.1 曲线方程和线性范围

使用1.2.3中的混合标准中间液配制成一系列的混合标准工作液，以最优的色谱条件将系列混合标准工作液上机测试，以化合物浓度作为横坐标，以化合物峰面积作为纵坐标绘制成标准工作曲线，所得曲线方程、相关系数和线性范围见表1。

表1 目标化合物的曲线方程、相关系数和线性范围

从表1可以看出，7种化合物在0.05～100μg/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数均≥0.9998，满足试验要求。

2.5.2 检出限与定量限

试验以3倍信噪比作为检出限（LOD），以10倍信噪比作为定量限（LOQ），通过向空白样品中添加目标物的方式来确定检出限和定量限值。所测得的结果见表2。

表2 目标化合物的检出限、定量限、回收率和精密度

从表2可以看出，噻苯达唑检出限为0.025mg/kg，定量限为0.10mg/kg，5-羟基噻苯达唑等6种化合物检出限为0.05mg/kg，定量限为0.20mg/kg。

2.5.3 回收率试验

使用空白样品分别进行了检出限、定量限以及10倍检出限的添加回收试验，试验所得结果见表2。从表2可以看出，7种化合物的回收率在68.9%～94.5%之间，回收效果良好。

2.5.4 稳定性试验

在回收率试验的基础上，将每个组别再同时做6平行的添加试验，以测定的试验结果计算7种化合物的日内变异系数，并将样品保存于4℃阴暗处，连续测定3d，记录试验结果，计算7种化合物的日内和日间变异系数，所得结果见表2。从表2可以看出，7种化合物的日内变异系数在0.7%～3.4%之间，日间变异系数在1.5%～4.8%之间，证明该方法稳定性良好。