奶牛隐性乳房炎诊断方法研究进展

2022-12-28张艳冯万宇徐馨薛沾枚刘雪松张备李平吴宪陈亮史同瑞

中国奶牛 2022年7期

张艳，冯万宇，徐馨，薛沾枚，刘雪松，张备，李平，吴宪，陈亮，史同瑞

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，齐齐哈尔 161005）

奶牛发生乳房炎后不仅其产奶量、乳汁品质均有不同程度下降、治疗费用增加，而且炎性乳汁还危害着公共卫生和消费者的健康，重症乳房炎患牛因产乳量的明显减少甚至失去泌乳能力而被淘汰，因此，做好奶牛乳房炎精确诊断与早期预警对乳房炎防控具有重要意义。长期以来，一些学者一直致力于奶牛乳房炎的诊断研究，一些新的诊断方法不断涌现。但临床应用中仍是采用乳汁体细胞诊断方法较为普遍，若新技术可以发挥其作用或新技术可以与传统技术结合起来，对奶牛隐性乳房炎的早期诊断将更为准确，能更好地服务于养殖业。因此，本文综述了近年来有关奶牛乳房炎诊断的研究成果，旨在为奶牛乳房炎诊断提供技术参考。

1 乳汁体细胞诊断

1.1 乳汁体细胞诊断方法原理

牛奶体细胞（somatic cell）为免疫细胞及其他细胞的统称。健康奶牛乳汁中的体细胞数（SCC）较少，主要由巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和乳腺上皮细胞等组成，其中，巨噬细胞占60%～88%，主要起保护功能并发起炎性反应，淋巴细胞占10%～30%，中性粒细胞占1%～15%，上皮细胞约小于7%。当奶牛发生乳腺感染时，炎症因素能够导致乳汁中的体细胞数急剧增多，而且乳汁内的体细胞种类及其数量发生很大的变化[1]，其中中性粒细胞占绝大多数，占95%～99%。由于乳腺炎病原、病症，以及感染阶段的不同，乳汁中体细胞种类与数量也存在着明显的差异，其中，尤为以中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的变化明显[2,3]。一般情况下，乳汁中巨噬细胞的增多预示乳房发生慢性炎症、非化脓性炎症；淋巴细胞的增多预示为慢性炎症或发生病毒性感染；中性粒细胞增多则预示为急性炎症及炎症早期[4,5]。

1.2 乳汁体细胞诊断方法的应用

奶牛乳汁体细胞数能相对准确地反映乳腺炎症的严重程度，并被广泛作为奶牛乳房炎的诊断指标。国际乳品联盟（IDF）推荐使用体细胞检测和细菌学检测作为判定奶牛乳房炎的方法。随着奶牛生产性能测定技术（DHI）在国内牧场的逐渐普及，体细胞数的快速检测在奶牛乳房炎诊断，特别是隐性乳房炎诊断中发挥了重要作用。在十二烷基磺酸钠等阴离子表面活性剂和碱性物质的作用下，脂类物质乳化，乳中体细胞细胞膜被破坏，并释放出细胞DNA，DNA与其作用使乳汁产生沉淀或形成凝胶状。根据沉淀或凝胶的多少，能够间接判定体细胞数的数量[1]，从而诊断乳房的感染严重程度。根据此原理相继建立了显微镜直接计数法、体细胞仪计数法、荧光电子细胞计数法、粒子计数法、白细胞分类计数法等直接计数检验法，以及加利福尼亚乳房炎试验、苛性钠凝乳试验法、过氧化物酶试验等体细胞间接检验法，并用于隐性乳房炎的诊断。

随着研究深入，一些新的诊断方法相继出现。安朋朋等研究了体细胞分型指数（DSCC）的变化规律，以及乳房炎致病菌对DSCC的影响。DSCC是指淋巴细胞与嗜中性粒细胞总数占体细胞数的比例，结果显示，体细胞评分与DSCC存在极显著相关性，且随着体细胞评分值的升高，DSCC波动范围逐渐减小；头胎牛、4胎以上奶牛的DSCC值显著高于2至3胎牛；细菌感染阳性样品DSCC（77.21%）极显著高于阴性样品（69.33%），但传染性致病菌感染与环境性致病菌感染的样品间DSCC无显著差异，由此表明，DSCC对于诊断乳房炎具有一定价值[5]。刘建营等研究SCC和DSCC之间的关系，结果表明，随着SCC的不断升高，DSCC也会不断提升，二者呈正相关，DSCC＞57.24%时，奶牛发生乳房炎的几率较大[6]。谷淑华等调查了SCC和DSCC在河南奶牛健康管理中的应用情况。他们重新定义奶牛健康状况并将奶牛分为：健康组、疑似或初期乳房炎组、乳房炎组、慢性或持续性乳房炎组，然后进行相关分析。结果显示，与其他各组相比健康组的产奶量、乳脂率和乳蛋白含量最高，随着时间与胎次的增加，乳房炎组和慢性或持续性乳房炎组患牛数量持续增加，综合看出，未来若能制定出更佳配套的管理措施，此方法在奶牛乳房健康监测中将发挥巨大的作用[7]。

2 乳汁酶学诊断

2.1 乳汁酶学诊断方法原理

在奶牛乳腺发生病原性感染后，致病病原会引起乳腺组织发生一系列的炎性变化，并动员大量免疫细胞至乳腺组织内，其中90%为嗜中性多形核白细胞，大量嗜中性多形核白细胞进入炎性乳腺，并吞噬入侵的病原，致使体细胞数持续升高。奶牛发生乳房炎时，乳腺内的炎性细胞释放的炎性成分将造成乳腺微血管的通透性增加，破坏血乳屏障，血液中的体细胞、溶酶体酶和急性期蛋白等成分渗入至牛乳中，并导致N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG）等一些酶的生物活性升高。

2.2 乳汁酶学诊断方法的应用

NAG存在于乳腺组织和白细胞中，当乳腺细胞受到损伤或白细胞数升高时，NAG活性会显著升高[8]，因此，NAG活性与奶牛隐性乳房炎发生密切相关，其活性能够反映乳腺是否存在感染的风险。NAG能够预示分泌型细胞的状态及乳腺发病程度，目前，已有商业化的NAG测定试剂盒，并用于隐性乳房炎的诊断中[9～11]。刘小倩等在研究长期饲喂高精料可否致奶牛发生内源性乳房炎的试验中，应用ELISA试剂盒测定了乳及乳腺组织中NAG、碱性磷酸酶（AKP）、髓过氧化物酶（MPO）及脂多糖（LPS）等炎性指标，试验表明，牛乳中NAG、AKP活性显著上升，LPS含量极显著升高，其他指标差异不显著。结果说明，NAG、LPS和AKP可作为隐性乳房炎的诊断指标[8]。印度学者建立了一种斑点试验，根据奶样中胰蛋白酶抑制剂的检测结果诊断隐性乳房炎，该方法敏感性和特异性分别为88.2%和89.8%。Ball等通过检测NAG判断是否为隐性乳房炎。葛影影等研究奶牛血清因子、生理生化指标与奶牛乳房炎的关系，结果表明，牛血清因子、生理生化指标与奶牛乳房炎的发生密切相关，其中，IL-1β、IL-8、白蛋白（ALB）水平和NAG活性的显著变化与乳房炎的感染和发生关系密切[12]。

髓过氧化物酶（MPO）是PMN、单核细胞、巨噬细胞释放的嗜天青颗粒的主要成分，是氧依赖性杀菌系统的重要组成部分。AKP是机体防御感染的因子之一[10]。薛永康等探索了奶牛隐性乳房炎的早期诊断指标，结果表明，乳清中血清触珠蛋白（HP）、血清淀粉样蛋白A（SAA）、α-1酸性糖蛋白（AGP）、C反应蛋白（CRP）等的含量与乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖苷酶（NAG）、过氧化氢酶（CAT）等的活性均可辅助诊断奶牛隐性乳房炎。瑞典学者制备了奶牛MPO单克隆抗体，建立了针对牛乳MPO的MPO-ELISA方法[13]。牛国庆等研究了以MPO作为诊断奶牛乳房炎的检测效果，结果显示，乳样中SCC水平与MPO含量呈正相关，采用ELISA检测乳样中MPO水平可以快速、简便地对奶牛乳房炎做出早期诊断[14]。

组蛋白去甲基化酶（HDMs）是可以脱去组蛋白甲基化的一类酶。王晶晶利用脂多糖构建了体内和体外大肠杆菌源性的临床型乳腺炎模型，测定了HDMs表达水平，结果显示，模型构建成功后HDMs家族的两类去甲基化酶——赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）、十字形结构域蛋白3（JMJD3）基因及蛋白表达量均显著提升[15]。

3 血清学炎性蛋白指标诊断

3.1 血清学炎性蛋白指标诊断方法原理

炎症会激发动物机体产生急性炎性反应，在炎症过程中急性期蛋白含量将显著升高。奶牛发生隐性乳房炎后，HP、AGP、SAA等会随着炎症的发展而增加，且CRP也与SCC具有一定相关性。在急性炎症反应期，动物在肝脏中合成血清淀粉样A蛋白（SAA）、结合珠蛋白（Hp）等急性期蛋白来抵御感染。Eckersall等报道，急性反应期最显著的特征是肝脏中合成急性期蛋白水平升高，其中SAA、HP是目前认为最敏感的指标。

3.2 血清学炎性蛋白指标诊断方法的应用

HP又称触珠蛋白，是一种酸性糖蛋白。健康牛血清HP浓度低于20mg/L，乳房炎牛2d内升至2g/L。HP还可作为子宫炎、肠炎、肺炎等的指征。SAA在急性炎症刺激下，血清SAA1、SAA2水平在5～6h升高约1000倍。AGP又称类黏蛋白，蒋磊选取健康奶牛和不同发病程度隐性乳房炎患牛，采用α1-酸性糖蛋白ELISA试剂盒测定各组乳清样品中α1-酸性糖蛋白的含量，结果显示，隐性乳房炎组奶牛乳清中α1-酸性糖蛋白的含量显著或极显著高于健康组奶牛，且随着奶牛隐性乳房炎病情的加重及乳中体细胞数的增加，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈现出递增趋势，乳腺炎症引发的乳腺损伤及乳中体细胞数增加与乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈正相关性[16]。苏传友等研究表明，高体细胞数可以上调牛乳中蛋白含量，如α-1-微球蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4和抗菌肽4等，可以根据血清中蛋白含量的变化对奶牛的早期乳腺炎进行判断[17]。刘海燕等研究证实，乳房炎期间乳清中转铁蛋白和白蛋白含量升高，而α乳清蛋白和β乳球蛋白含量降低[18]。宋洁等研究表明，奶牛血清中α乳蛋白与体细胞计数相关性为0.60，血清中乳蛋白可作为乳房炎诊断依据[19]。汪悦等研究发现，奶牛血清或乳汁中结合珠蛋白、血清淀粉样蛋白和α-酸性糖蛋白等在乳房炎诊断中具有重要价值[20]。

4 致病菌PCR诊断

4.1 致病菌PCR诊断方法原理

奶牛乳腺炎的诱发因素有很多，微生物因素、饲养管理因素和自身免疫因素等均可以引起。其中，微生物如链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等均可通过乳腺管进入乳房内并大量滋生，导致奶牛乳房炎。大量的研究表明通过PCR方法单一或多重检测致病菌可早期诊断奶牛乳房炎。

4.2 致病菌PCR诊断方法的应用

王宇等建立了能够同时检测奶牛乳房炎无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌等致病菌的多重PCR方法，结果表明，建立的快速诊断方法对3种致病菌的最低检测限量分别为8×104cfu/mL、4×104cfu/mL和1.5×105cfu/mL[21]。邓凯伟等还建立了能够同时检测奶牛乳房炎大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙雷氏菌等致病菌的多重PCR方法[22]。夏振海等采用TaqMan探针-荧光定量PCR技术快速筛查生鲜乳中含有的主要致病菌，结果从检测乳样中分离到大肠杆菌、黏质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌、乳房链球菌和无乳链球菌等致病菌[23]。张莉莉等建立了奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man荧光PCR检测方法，结果表明，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌3种致病菌阳性质粒DNA最低检测限量为103拷贝数/μL、102拷贝数/μL和104拷贝数/μL，且特异性好，与沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌等无交叉反应[24]。王仕成建立了奶牛乳房炎致病菌4重PCR诊断方法，结果显示，方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌阳性质粒DNA最低检测限量为1pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、1pg/μL，方法的重复性好、特异性高[25]。夏颖等建立了同时检测奶牛乳房炎致病菌的3重PCR检测方法，结果显示，方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌阳性质粒DNA最低检测限量为10-3mg/L，与大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌和巴氏杆菌不存在交叉反应，方法的特异性高、重复性好[26]。