阿苯达唑及其亚砜在鲫鱼体内的药动学及残留消除

奚照寿， 袁华根， 丁丽军

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

阿苯达唑(albendazole，简称ALB)为苯并咪唑类抗寄生虫药，广泛用于畜禽及水产养殖中体内外寄生虫的防治。因此，有关阿苯达唑在食品动物的药动学研究也较多，但大多集中于家畜体内，国内外对于阿苯达唑在鱼体内的药动学及残留研究尚未见报道。由于缺乏应用阿苯达唑防治鱼类寄生虫病的药动学数据与资料，目前在水产养殖中应用阿苯达唑时，主要是参考该药在畜禽上的应用经验。本研究拟研究口服给药后，阿苯达唑及其亚砜在鲫鱼体内的药动学，并通过多次给药研究阿苯达唑在鲫鱼肌肉中的残留消除规律，以期为指导水产养殖中阿苯达唑的合理用药及残留监控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

体质量(150±20)g/尾鲫鱼，购自某渔场。饲养于大小为2.2 m×1.9 m×0.8 m鱼池中，使用经曝气的自来水，水深 0.3 m，每池30尾，每周投食3次。所有鲫鱼试验前预养2周，试验期间不投食。

1.2 药品与试剂

阿苯达唑对照品(含量99.3%)、阿苯达唑原料药(含量98.3%)，由常州亚邦齐晖医药化工有限公司提供；阿苯达唑亚砜对照品(含量99.5%)，由常州市亚邦兽药有限公司提供。流动相用乙腈、甲醇为HPLC级，样品前处理乙腈、甲醇、乙酸乙酯等有机试剂为分析纯。

1.3 仪器及其他

SHMADZU高效液相色谱仪(日本岛津公司)；ODS-2HYPERSIL不锈钢色谱柱(Thermo ELECTRON CORPORATION)；C18保护柱[翡纳米(天津)科技发展有限公司]。

1.4 动物给药与采样

1.4.1 口服给药的药动学 水温设定为15～18 ℃，将60尾鲫鱼，随机分为12组，每组5尾。每尾灌服阿苯达唑 12 mg/kg。口服给药后12、20、26、34、36、38、44、48、60、72、96 h 采集尾静脉血约1 mL，分离血浆，-20 ℃保存。

1.4.2 口服给药的残留消除 40尾鲫鱼于水温(20±1)℃下，随机分为8组，根据体质量按12 mg/kg的剂量灌服给予阿苯达唑溶液，每天1次，连续5 d。于最后一次给药后0.5、1、2、4、8、12、24 d各剖杀1组，取肌肉样品，置于-20 ℃保存。

1.5 测定血浆阿苯达唑及其亚砜浓度

1.5.1 血浆样品预处理 取血浆样品0.25 mL于EP管中，加1 mL乙酸乙酯沉淀蛋白，涡旋混合3 min后，3 500 r/min离心15 min，吸取上清液于50 mL鸡心瓶中，65 ℃旋转蒸干，之后用0.5 mL流动相溶解，涡旋混合2 min，转入1.5 mL EP管，高速离心5 min(16 000 r/min)，经0.45 μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析。

1.5.2 HPLC测定条件 流动相：体积比33 ∶67的乙腈-KH2PO4溶液(0.05 mol/L)；检测器：紫外吸收检测器；检测波长：292 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；紫外检测器灵敏度：0.020 AUFS；进样量：20 μL。在上述检测条件下，在空白血浆样品中添加系列浓度的阿苯达唑或其亚砜的标准工作液，经预处理后分别测定血浆中阿苯达唑及其亚砜浓度，确定标准曲线及线性范围、定量限(LOQ)与检测限(LOD)、回收率、精密度。

1.6 测定组织中阿苯达唑及其亚砜的药物浓度

1.6.1 组织样品预处理 肌肉样品剪碎后准确称取2.5 g于50 mL离心管中，加入12 mL乙酸乙酯，涡旋混合3 min，匀浆2 min(15 000 r/min)，匀浆刀头用12 mL乙酸乙酯清洗，且清洗液转入匀浆液中，超声提取10 min，3 500 r/min离心 10 min，将上清液转入50 mL鸡心瓶中，65 ℃蒸干。利用 2 mL 流动相溶解鸡心瓶中的残渣，涡旋2 min，转入10 mL玻璃离心管中，再用3 mL正己烷清洗鸡心瓶，合并清洗液于玻璃离心管，涡旋3 min，离心5 min(4 000 r/min)，弃去正己烷层，再加入3 mL正己烷涡旋混合，离心，弃去正己烷层。将底层液体转入另一离心管中，16 000 r/min离心5 min，0.45 μm滤膜过滤，供HPLC分析。

1.6.2 HPLC测定条件 流动相：体积比3 ∶7的乙腈-KH2PO4溶液(0.05 mol/L，pH值3.5)；其余同“1.5.2”节。

1.7 数据分析处理

利用药代动力学软件3P97处理鲫鱼口服给药后的血浆药物浓度-时间数据以及肌肉药物浓度-时间数据，自动拟合最佳药动学模型，推导药动学参数。

2 结果

2.1 鲫鱼血浆及肌肉组织中阿苯达唑药物浓度的HPLC检测方法

所建立的色谱条件下，能较好地将阿苯达唑、阿苯达唑亚砜与血浆或肌肉组织中其他基质组分完全分离开。血浆中阿苯达唑及阿苯达唑亚砜出峰时间为21.10 min和4.00 min，峰形良好；肌肉中的保留时间分别为24.0 min和4.4 min，峰形对称，峰宽较窄。

基质加标标准曲线显示，阿苯达唑在0.1～1.6 mg/L范围内，阿苯达唑亚砜在0.012 5～1.6 mg/L范围内，线性良好，相关系数大于0.999。

血浆中，阿苯达唑及其亚砜平均回收率介于82.93%～97.45%之间，变异系数分别为3.40%～3.70%和4.16%～4.53%，LOD分别为0.05、0.006 25 mg/L，LOQ分别为0.1、0.012 5 mg/L。肌肉组织中，阿苯达唑及其亚砜的回收率在82.39%～97.25%之间，变异系数分别为2.59%～5.26%、2.46%～4.36%，LOD分别为0.05、0.006 25 mg/kg，LOQ分别为0.1、0.012 5 mg/kg。

2.2 口服给药的药动学特征

鲫鱼口服阿苯达唑(12 mg/kg)后，血药浓度时间数据可用一级吸收一室开放模型拟合，血浆中阿苯达唑亚砜的药动学参数见表1。

表1 鲫鱼血浆中阿苯达唑亚砜的药动学参数(单剂量口服阿苯达唑12 mg/kg)

2.3 口服给药残留消除结果

在(20±1)℃水温下，鲫鱼多剂量口服阿苯达唑(12 mg/kg)后，肌肉浓度-时间数据可用一级吸收一室开放模型拟合。肌肉中阿苯达唑亚砜的药动学参数见表2。

表2 鲫鱼多剂量口服阿苯达唑(12 mg/kg)后阿苯达唑亚砜的残留参数

3 讨论

3.1 检测条件和样品预处理方法的选择

国内外有关测定畜禽血浆中阿苯达唑及其代谢物的分析方法已有报道[1-4]。本试验在已报道方法的基础上优化了血浆及肌肉样品预处理方法。本试验采用乙酸乙酯为提取液不但能够将样品中的蛋白沉淀，对待测组分的提取效果也较好，而且乙酸乙酯对于操作人员安全无毒，样品只需提取1次，提取的上清液澄清，易蒸干，提取过程较沙先谊等[2]和邱银生等[3]的方法简单，灵敏度更高。HPLC结果显示空白血浆样品中杂峰少，干扰小，血浆中阿苯达唑亚砜保留时间与沙先谊等和邱银生等的研究结果[2-3]基本一致，而阿苯达唑的保留时间与之相比则较晚，但药物峰形好，拖尾因子小，可以满足鲫鱼血浆及肌肉组织中阿苯达唑和阿苯达唑亚砜药物动力学及药物残留研究的要求。肌肉样品预处理方法与Casetta等[5]和林海丹等[6]的相比，过程简单，少量的乳化和不过小柱处理对出峰情况基本无影响，肌肉中阿苯达唑及其亚砜的回收率达到80%以上。肌肉中阿苯达唑及其亚砜检测方法与邱银生等和Fletouris等相比，空白样品杂峰少、干扰小，阿苯达唑的保留时间较长，但峰形较好。在该条件下，肌肉中阿苯达唑及其亚砜的回收率、检测限、定量限及日内、日间变异系数均可满足鲫鱼肌肉中阿苯达唑及其亚砜残留分析的要求。

3.2 鲫鱼口服给药的药动学特征

阿苯达唑在动物体内代谢迅速，极少以原形药物存在，主要代谢为阿苯达唑亚砜和阿苯达唑砜[7]。水温条件为15～18 ℃时，鲫鱼口服(12 mg/kg体质量)阿苯达唑后，血浆中阿苯达唑亚砜的药物浓度-时间变化规律符合一级吸收一室开放模型，药物吸收缓慢，药物浓度低，代谢物消除亦较慢，表观分布容积较小。与猪或羊单剂量内服阿苯达唑后的药动学参数相比[1]，在本试验条件下，阿苯达唑亚砜在鲫鱼的达峰时间比较长，消除半衰期为11.9 h，长于阿苯达唑亚砜在猪体内的半衰期，但比在羊体内的短。

3.3 残留消除特点与休药期

在(20±1) ℃水温下，鲫鱼以12 mg/kg体质量的给药剂量多剂量口服阿苯达唑，停药后0.5～4 d内阿苯达唑亚砜代谢物的生成速率大于消除速率，肌肉中的药物浓度处于上升趋势，4 d时达到峰浓度0.787 mg/kg，之后开始下降，8 d时下降到0.064 mg/kg，24 d时药物浓度低于检测限。阿苯达唑在鲫鱼口服给药的残留消除特征是，消除速率常数Ke为0.359 h-1，消除半衰期为1.971 d，停药后24 d，药物浓度低于检测限。

鱼类动物的体温会随着水温的变化而变化，其采食量、新陈代谢也会随着水温的变化而改变，鲫鱼最适合的生长温度在20～28 ℃之间，在非适性温度条件下，其代谢强度明显下降，进而影响消除速率[8]。据统计，在最适生长温度范围内鱼的体温每增加1 ℃，药物在鱼体内的代谢速率就增加10%[9]。药物在鱼体内的消除速度随水温的降低而减慢，即药物的半衰期会随着水温的降低而延长[10]。

我国规定阿苯达唑在鱼组织中的休药期为500 ℃·d，本研究在(20±1) ℃水温条件下，鲫鱼多剂量口服给药阿苯达唑(12 mg/kg体质量)，连续用药5 d，停药后24 d阿苯达唑亚砜低于最低残留限量标准，结果与我国的休药期相符合。但是对于其他种类的鱼来说，还需要试验进一步验证。

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