高效液相色谱串联三重四极杆质谱法同时检测鲜乳中5种黄曲霉毒素

谭 炜，张 雷，张咪咪，安 虹

1.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051；2.国家农副加工食品监督检验中心，安徽合肥 230051

真菌毒素是真菌在生长繁殖过程中产生的一系列次级代谢产物，目前在自然界中已发现的真菌毒素有400多种[1]。其中大部分真菌毒素具有致畸、致癌、致突变、肝肾毒性、免疫毒性和神经毒性等危害，严重危害人类健康[2]。呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素M1（AFT-M1）、黄曲霉毒素B1（AFT-B1）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮(ZON)等，在食品领域报道较为常见[2-5]。目前，国内外对真菌毒素的检测多采用薄层法、酶联免疫法、气质联用法、液相法、液质联用法等[6]。然而，薄层法虽然快捷，但是重复性差、精度不高；酶联免疫法特异性强，但假阳性率高；气质联用法前处理繁琐；液相法稳定、灵敏，但无法同时分析检测同系物或异构体。液质联用法，选择性好、灵敏度高、适用性强且能多组分同时检测。已被广泛应用于真菌毒素检测，成为食品检测领域的研究热点[7]。

鲜奶中的真菌毒素源自奶牛的饲料，污染饲料的真菌种类繁多，导致牛奶中往往有多种真菌毒素同时存在[8]。本研究旨在建立一种液相色谱串联三重四极杆质谱法同时检测牛奶中5种黄曲霉毒素的方法。

1 实验部分

1.1 仪器

超高效液相色谱仪LC-30A串联三重四极杆质谱仪LCMS-8050，日本岛津公司；Reax top涡旋混合器，德国Heidolph集团；KDC-160HR高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；N-EVAP-34型氮吹仪，美国Organomation公司；PURELAB flex 3超纯水机，法国威立雅公司；S300H超声波清洗器，德国Elma公司。

1.2 分析条件

液相色谱条件：LC-30A系统；Waters ACQUITY BEH C18（1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇；流速：0.3 mL/min；进样体积：10 μL；柱温40℃；洗脱方式：梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱时间程序

质谱条件：分析仪器：LCMS-8050，离子源：ESI，正离子扫描，离子源接口电压：4.5 kV，雾化气：氮气3.0 L/min，干燥气：氮气15 L/min，碰撞气：氩气，脱溶剂管温度：250℃， 加热模块温度：400℃，扫描模式：多反应监测(MRM)，驻留时间：30 ms，延迟时间：3 ms。MRM参数见表2。

表2 MRM参数

1.3 样品制备标准溶液配制

取适量单标储备液，用乙腈配制成10 mg/L的混合标准溶液，用水逐级稀释成浓度为20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL的标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取取5 g(精密称定至0.01 g)样品于20 mL乙腈/水(85/15，v/v)中涡旋2 min，超声45 min，8 000 r/min离心10 min后，取上清液2 mL于25 mL容量瓶，用1%吐温-20 PBS稀释并定容后,取上清液于50 mL量瓶中,以乙腈/水(70/30，v/v)稀释定容至50 mL，备用。

1.4.2 净化将提取的液体过免疫亲和柱，用10 mL PBS淋洗柱子，吹干，再用5 mL的甲醇洗脱，吹干，收集洗脱液，并用氮气吹干，用1.0 mL乙腈/水(20/80，v/v)溶液溶解残留物，过0.22 pm滤膜并收集滤液，进行LCMS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 标准样品的MRM色谱图

10 ng/mL混合标准样品的MRM色谱见图1。

图1 混合标准样品的MRM色谱图

2.2 线性关系、检出限及定量限考察

将 浓 度 为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的 混 合标准工作液，按分析条件进行测定，以浓度比为横坐标，以峰面积比为纵坐标，外标法制作校准曲线；通过在不含真菌毒素的鲜奶基质中加入相应量的真菌毒素混合标准品，配制基质匹配的系列标准溶液(1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L）， 按分析条件进行测定，以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标进行线性回归分析。方法的回归方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限见表3。

表3 线性关系、检出限及定量限

2.3 回收率和精密度实验

对1 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL混合标准溶液连续进行6次进样，3个浓度标准品的回收率范围在81.0%~115.8%，表明该方法准确、可靠；相对标准偏差为1.5%~8.8%之间，表明方法精密度良好。

2.4 实际样品测定

取25批鲜奶样品，按照分析条件和样品前处理方法同时检测其中的5种真菌毒素含量，在25批样品中共有3组检出AFT-M1，含量分别为0.18 μg/kg、0.21 μg/kg、0.25 μg/kg，其 他毒素含量均低于检出限。表明该方法快捷、有效，适用于鲜乳中5种真菌毒素的高效检测。

3 结束语

本研究建立了一种超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪的方法能同时高效测定鲜乳中5种常见的真菌毒素。5种毒素在1~20 ng/mL浓度范围内线性良好；低、中、高3个浓度加标回收率和相对标准偏差分别在81.0%~115.8%和1.5%~8.8%之 间，具有较高的准确性和精确度，且无需内标，前处理操作简单、快捷。

表4 3个浓度水平的加标回收率和精密度实验(n=6)

表5 实际样品测定结果