人参总皂苷对伊立替康及其代谢产物在大鼠体内药动学的影响*

朱延焱，冯炎林，梅紫薇，胡国新，平丽，田伟强

(1.浙江省丽水市中心医院药学部，丽水 323000；2.温州医科大学药学院，温州 325035；3.浙江大学药物安全评价研究中心，杭州 310058)

人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey的根。现代药理研究表明，人参具有广泛药理活性，包括抗肿瘤、抗高血压、抗疲劳、增强免疫等作用[1]。含人参的中药制剂临床广泛用于恶性肿瘤的辅助治疗。有研究指出，含人参制剂可以减少化学治疗(化疗)所致不良反应[2]，亦有观点认为人参可以提高化疗疗效。伊立替康(irinotecan，CPT-11)是半合成喜树碱衍生物，属选择性DNA 拓扑异构酶Ⅰ抑制剂。2020年美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)结肠癌[3]、直肠癌[4]指南推荐：CPT-11与氟尿嘧啶、亚叶酸钙联合(FOLFIRI方案)是复发或转移性结直肠癌的一线化疗方案，疗效确切。笔者在本实验观察人参总皂苷与CPT-11合用后，CPT-11及其活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38)在大鼠体内药动学的变化，以期为临床中西药联用提供参考。

1 材料与方法

1.1仪器 超高液相色谱-XEVO TQD 三级四重杆串联质谱联用仪(美国Waters)，含有电喷雾离子源(electro-spray ionization，ESI)，色谱工作站：Masslynx 4.1；Beckman 22R台式TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW-80A涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；XS105分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.01 mg)；Milli-Q A10 超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2试药 注射用盐酸伊立替康(江苏恒瑞医药股份有限公司，规格：每支40 mg，批号：180712AF)；SN-38(江苏恒瑞医药股份有限公司，纯度>98%，批号：A0816AS)；人参总皂苷(西安维奥生物科技有限公司，批号：171110，总皂苷含量≥80%)；卡马西平片(江苏鹏鹞药业有限公司，批号：1606161，规格：每片0.1 g)；甲酸(色谱级，Aladdin chemistry Co.，Ltd，批号：E2022005)；乙腈(色谱级，Tedia Company，批号：19085037)和甲醇(色谱级，Tedia Company，批号：19055136)；其余常规化学试剂均为分析纯或优级纯(上海化学试剂公司)。

1.3实验动物 SD大鼠12只，无特定病原体(SPF)级，雌雄各半，体质量220～250 g，均购自温州医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号：SYXK(浙)2015-0009。所有SD大鼠饲养在温度相对恒定和自然通风的实验环境下[温度(25±1)℃，相对湿度(55±10)%，12 h光照和12 h黑暗交替，给予标准饲料喂养，自由饮水]，适应7 d后进行实验。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流动相：A 0.1%甲酸-B乙腈 (77：23)，流速：0.4 mL·min-1，柱温：35 ℃，进样量2 μL。总运行时间为2.5 min。Masslynx 4.1版软件(Waters Corp.)用于数据采集和仪器控制。

2.2质谱条件 采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式，正离子MRM方式检测，驻留时间200 ms。扫描范围m/z：100→1000。MRM模式下CPT-11、SN-38、卡马西平离子跃迁分别为m/z587.3→167.2、m/z393.2→349.2、m/z237.1→194.2。ESI，电离电压；3.5 kV，锥孔电压：30 V，离子源温度150 ℃；雾化温度 498 ℃；雾化气流速 800 L·h-1，锥孔气流速50 L·h-1，碰撞气流速0.15 mL·min-1。

2.3血浆样品的处理 血浆样品采用乙腈沉淀蛋白方法，取大鼠血浆100 μL，加入乙腈200 μL，100 ng·mL-1卡马西平100 μL，涡旋2 min，13 000 r·min-1离心10 min (r=17 cm)，取上清液100 μL，加入超纯水100 μL，混合后进样2 μL，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法分析，测定大鼠血浆CPT-11及SN-38含量。

2.4给药方案与样品采集 SD大鼠12只，体质量220～250 g，雌雄各半，采用随机数字表法分成实验组与对照组，每组6只，禁食12 h后于实验当天上午给药，实验组灌胃人参总皂苷400 mg·kg-1，0.5 h后尾静脉注射CPT-11 20 mg·kg-1；对照组灌胃同体积0.9%氯化钠溶液，0.5 h后尾静脉注射CPT-11 20 mg·kg-1，分别于给药后 0.083，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24 h经尾静脉取血约 0.2 mL，置含肝素的抗凝试管，13 000 r·min-1离心10 min(r=17 cm)，上清液即血浆，-20 ℃ 保存待处理。

2.5方法学考察

2.5.1方法专属性考察 取 SD大鼠空白血浆100 μL，置 1.5 mL EP管，其余按“2.3”项下血浆样品处理方法操作，在本实验UPLC-MS/MS条件下进样2 μL分析，获得空白血浆色谱图；将一定浓度CPT-11标准系列溶液加入空白血浆，同法操作，获得相应色谱图，取静脉注射CPT-11后 SD大鼠 30 min时间段血浆样品，同法操作，得色谱图。血浆内源性杂质不干扰样品测定。同法测定大鼠血浆SN-38方法专属性。CPT-11保留时间0.43 min，SN-38保留时间0.75 min，内标卡马西平保留时间1.57 min，三者分离良好并在相应离子通道中相不干扰，见图1。

A.空白血浆；B.CPT-11；C.SN-38；D.卡马西平；E.CPT-11+SN-38+卡马西平。

2.5.2线性范围与定量限考察 精密量取4 mg·mL-1内标卡马西平溶液70 μL，加入CPT-11系列浓度溶液20 μL，置1.5 mLEP管，离心浓缩系统挥干，加入大鼠空白血浆100 μL，配制成CPT-11血浆浓度分别为0.005，0.05，0.5，1，2，5，20 μg·L-1标准模拟血浆工作曲线，按“2.3”项方法处理。所得结果以CPT-11血浆浓度为横坐标，所得CPT-11及内标峰面积比值为纵坐标，以最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程：Y=9998X(r=0.999)在0.005～20 μg·L-1内线性关系良好，考察定量下限为0.001 μg·L-1。同法测得大鼠血浆SN-38回归方程为：Y=9918X(r=0.999)在0.005～20 μg·L-1内线性关系良好，考察定量下限为0.001 μg·L-1。

2.5.3精密度实验 配制低、中、高浓度CPT-11血浆质控样本，按“2.3”项进行处理，进样2 μL，UPLC-MS/MS法分析。每浓度样品5个，连续测定 3 d，考察日内及日间精密度。CPT-11日内精密度与日间精密度RSD分别为5.71%～7.30%、5.71%～9.33%。同法测得大鼠血浆SN-38日内及日间精密度，RSD分别为5.73%～7.68%、3.20%～9.35%。

2.5.4回收率实验 配制低、中、高浓度CPT-11血浆质控样本各6份，按“2.3”项操作，进样2 μL测定，记录CPT-11峰面积(As)；另取空白血浆，按“2.3”项操作，得空白基质，再加入用流动相配制的CPT-11对照品溶液，制备含空白基质的复合溶液，进样2 μL测定，记录峰面积(Am)，按公式R=As/Am×100%，计算提取回收率。本实验条件下，血浆CPT-11提取回收率88.81%～97.81%；RSD 3.35%～13.34%。同法测得大鼠血浆SN-38提取回收率95.60%～106.29%；RSD 3.18%～12.55%。

2.5.5稳定性实验 本实验条件下，测得低、中、高浓度血浆CPT-11样品，室温放置24 h稳定性，RSD 5.13%～7.18%；样品置-20 ℃冰箱保存0，1，3 d稳定性，RSD 8.09%～10.61%；样品两次解冻冻融稳定性，RSD 7.43%～12.11%。同法测定大鼠血浆SN-38室温放置24 h稳定性，RSD 3.40%～9.35%；样品置-20 ℃冰箱保存0，1，3 d稳定性，RSD 5.47%～8.85%；样品2次解冻冻融稳定性，RSD7.63%～10.63%

2.6CPT-11及其代谢产物SN-38药动学特征 UPLC-MS/MS法测定实验组与对照组各时间点大鼠血浆CPT-11及SN-38浓度，DAS 3.1 版药动学软件处理血药浓度-时间数据，采用统计矩方法求算相应药动学参数，其中Cmax为实测值。采用SPSS21.0版软件对主要药动学参数进行统计分析。药时曲线见图2，药动学参数结果见表1。

表1 两组大鼠血浆CPT-11与SN-38药动学参数

图2 两组大鼠血浆CPT-11与SN-38药-时曲线(n=6)

3 讨论

CPT-11是晚期或转移性结直肠癌一线化疗药物，化疗会导致严重不良反应，如骨髓抑制、迟发性腹泻、恶心呕吐、肝肾功能损害等，因此化疗期间临床上常使用辅助药物减轻化疗不良反应。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效。有研究显示，人参可以减轻化疗所致不良反应[2]。亦有观点认为，人参可以提高化疗疗效，增强化疗药物细胞毒作用。人参以及含人参的中药制剂是临床常用辅助药物，如参麦注射液、生脉胶囊等。常见用法是化疗当天联合应用，于化疗药物使用前给药。因此，本实验中大鼠给药时，实验组单次灌胃人参总皂苷，0.5 h后尾静脉注射给予CPT-11，以模拟临床常见给药方式。

临床FOLFIRI方案中CPT-11剂量是180 mg·(m2)-1，按照体表面积1.7 m2、体质量60 kg、根据人体与实验大鼠剂量换算，大鼠给药剂量约33.15 mg·kg-1，但预实验时大鼠死亡率较高，且状态很差，活动度严重下降，奄奄一息，提示给药剂量偏大。给药10 mg·kg-1，血药浓度太低，检测受限。笔者参考文献[5]，给药剂量定为20 mg·kg-1。CPT-11给药20 mg·kg-1，浓度测定与大鼠状态均较理想，因此本实验大鼠CPT-11给药剂量定为20 mg·kg-1。

CPT-11疗效与不良反应与SN-38紧密相关，SN-38活性是CPT-11原药1000倍，也是CPT-11剂量限制性毒性迟发型腹泻的主要原因。本实验条件下，大鼠给予人参总皂苷以及尾静脉注射CPT-11后，实验组与对照组药动学参数进行双尾配对t-检验，发现CPT-11大鼠体内药动学参数，实验组与对照组比较，人参总皂苷对CPT-11的药动学参数无明显影响，但明显延长SN-38大鼠体内半衰期(t1/2)，差异有统计学意义。

CPT-11在体内经羧酸酯酶(存在组织、血清以及肝细胞内)作用下，转化成具有活性的代谢产物SN-38，在体内另一个代谢途径经细胞色素P450，其中主要为CYP3A4代谢生成7-乙基-10-[4-N-(5-氨基戊酸)-1-哌啶基]-羰基氧喜树碱(7-ethyl-10-[4-N-(5-aminovaleric acid)-1-piperidyl]-carbonyloxycamp-tothecin，APC)和7-乙基-10-(4-氨基-1-哌啶基)-羰基氧喜树碱[7-ethyl-10-(4-amino-1-piperidinyl)-carbonyloxycamptothecin，NPC][6]。而人参的主要活性成分人参皂苷化合物K(compound K)、原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)、原人参三醇(Protopanaxatriol，PPT)对 CYP3A4均有强抑制性[7]。本实验条件下，与人参总皂苷合用，SN-38在大鼠体内半衰期延长，但对CPT-11药动学参数影响不大，这可能与人参皂苷给药方式有关。人参皂苷对CYP3A4酶的抑制作用单次给药作用不明显，需长期给药方可显现。另外影响CPT-11体内血药浓度还有一个重要因素，即肝细胞微粒体内将SN-38代谢成无活性的SN-38葡萄糖醛酸苷(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin glycuronide，SN-38G)酶，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucuronosylt transferase 1A1，UGT)[8]，UGT1A1基因多态性对CPT-11体内血药浓度有影响。因此研究人参总皂苷对CPT-11血药浓度的影响，可能需要进一步消除UGT1A1酶对CPT-11及SN-38的干扰。

笔者在本实验研究条件下发现人参总皂苷可以延长大鼠体内CPT-11及其活性代谢产物SN-38半衰期，但人参总皂苷对CPT-11及SN-38影响的作用机制，以及如何进一步消除其他因素影响，仍值得进一步研究。