安溪县青钱柳总三萜含量动态变化及萜类成分分析

陈旭鹏，陈由强，朱锦懋，陈建楠*

(1.福建师范大学生命科学学院， 福建 福州 350117;2.福建师范大学南方海洋研究院， 福建 福州 350117)

青钱柳CyclocaryaPaliurus是胡桃科Juglandaceae青钱柳属Cyclocarya植物，为我国特有的植物种，主要分布于福建、浙江、江苏、湖北等省份[1]。青钱柳主要含有萜类、黄酮、生物碱、多糖、有机酸等有益成分[2]，其中萜类物质占有较大比例，具有优良的药用价值，FANG等[3]研究表明青钱柳萜类物质能够显著增加3T3-L1细胞对胰岛素的敏感性，并增加葡萄糖的摄取；周琴等[4]研究表明青钱柳三萜能够保护STZ损伤的INS-1细胞，并促进INS-1细胞分泌胰岛素；LIU等[5]研究表明青钱柳三萜类化合物能够显著降低糖尿病小鼠的血脂水平。

萜类化合物是青钱柳重要的次生代谢物，它的积累与季节变化有着紧密的联系，青钱柳萜类物质的含量随着月份的变化而产生显著差异[6-7]，因此选择适宜的采收月份对青钱柳药材质量具有重要影响。研究青钱柳总三萜含量月份动态变化及积累趋势对科学采收青钱柳叶片具有重要意义。柏明娥等[8]研究表明浙江青钱柳4月至9月总三萜含量呈上升趋势，9月总三萜积累量高，最佳的采收月份为9月；夏和元等[9]研究表明湖北青钱柳6月、7月总三萜含量高，此时青钱柳叶片提取液能显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性。前人研究表明，在总三萜含量高的月份采收青钱柳叶片具有显著的降血糖活性，为了明确高总三萜含量的青钱柳叶片中降血糖成分，采用代谢组学的方法研究萜类的组成，为青钱柳药理活性的深度开发提供重要理论参考[10-11]。谷海燕等[12]采用UPLC-MS/MS分析三七的萜类代谢组，发现多种具有生物活性的人参皂苷；傅俊等[13]采用UPLC-QTOF/MS分析牛膝的萜类成分，共发现40种三萜皂苷，其中齐墩果酸型三萜皂苷有38种。

青钱柳保健产品的市场需求不断增加，目前福建省安溪县青钱柳人工种植区多集中于育种、栽培等[14-15]，然而青钱柳总三萜含量动态变化及适宜采收月份的萜类代谢组未见报道，因此本研究以福建省安溪县4月至11月青钱柳叶片为试验材料，定量分析总三萜质量分数，研究总三萜含量动态变化，探究适宜的采收月份，并通过UPLC-MS/MS进一步定性定量分析适宜采收月份的青钱柳萜类组成成分。本研究为探究适宜采收青钱柳叶片的月份和青钱柳叶片萜类化合物进一步开发药用价值及食品保健功能提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青钱柳样品于2021年采自福建泉州安溪县桃舟乡(E117.45′42′，N25.22′ 48′)，选取的采摘时期为4月至11月。在样地中随机选取植株高度相似、树冠大小相似、长势相似、生长状态良好的青钱柳，采收成熟的青钱柳叶片，液氮速冻后存放于超低温冰箱，样品1式3份用于测定总三萜质量分数和萜类代谢组分析。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1主要仪器 JXFSTPRP研磨仪(购自上海净信实业发展有限公司)、INFINITE M PLEX全波长酶标仪(购自TECAN公司)、KQ-500E数控超声波清洗仪(购自昆山市超声仪有限公司)、超速离心机(购自Thermo SCIENTIFIC公司)、超高效液相色谱(SHIMADZU Nexera X2)、串联质谱(Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

1.2.2主要试剂 冰醋酸、高氯酸、无水乙醇均为分析纯；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(购自国药集团化学试剂有限公司)，齐墩果酸标准品纯度>99%(购自阿拉丁公司)，香草醛分析纯>99%(购自麦克林公司)。

1.3 定量分析4月至11月青钱柳总三萜

精密吸取0.2 mg·mL-1的齐墩果酸标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL具塞试管中，置于氮吹仪内挥干溶剂，加入0.1 mL的5%香草醛-冰醋酸和0.8 mL高氯酸，混合均匀后60℃水浴酸解20 min显色，取出冰水浴3～5 min，加入5 mL冰醋酸，室温静置10 min，使用全波长酶标仪在550 nm处测吸光值，以齐墩果酸质量为纵坐标，吸光值为横坐标得到回归方程y=337.29x-15.31，R2=0.994 8。

取200 g青钱柳样品，真空冷冻干燥3 d后用研磨仪磨碎，过0.425 mm筛。称取0.5 g样品于250 mL锥形瓶中，加入95%乙醇50 mL超声提取1 h，8 000 r·min-1离心10 min，过滤，取上清。将上清稀释3倍后，取0.2 mL作为待测液于试管中，测定步骤参照标准曲线，总三萜含量计算公式：

式中x：样品总三萜的含量；m1：根据标准曲线计算出待测液中总三萜的质量 (μg)；v1：提取时加入无水乙醇的体积(mL)；f：稀释倍数；m2：样品质量 (g)；v2：测定时移取的溶液体积 (mL)。

1.4 UPLC-MS /MS检测青钱柳萜类物质

通过总三萜定量分析发现10月青钱柳总三萜积累量高，因此选取10月青钱柳叶片研磨成细腻粉末，用甲醇提取萜类物质，按料液比1∶100，涡旋混匀，超声提取5次，合并提取液后12 000 r·min-1离心10 min，弃沉淀取上清，过0.22 μm滤膜，保存于超低温冰箱以供上机分析。

采用超高效液相色谱(UPLC)和串联质谱(MS/MS)检测含有萜类化合物的青钱柳叶片提取液。液相条件：采用Agilent SB-C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)的色谱柱，柱温箱温度维持在40℃，A流动相为超纯水(0.1%的甲酸)，B流动相为乙腈(0.1%的甲酸)，梯度洗脱0.00～9.00 min B (5%～95%)，9～10 min B (95%)，10～11 min B (95%～5%)，11～14 min B (95%)，流速0.35 mL·min-1，柱温40℃，进样量4 μL。MS/MS质谱条件：离子源温度550℃，离子源喷雾电压5500V(+)/4500V(-)，离子源气体Ⅰ为50 psi，气体Ⅱ为60 psi，帘气(CUR)为25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高，三重四级杆扫描使用多反应监测模式(MRM)。

1.5 数据处理

采用spss 26.0软件进行单因素方差分析、Duncan多重比较、皮尔森相关系数分析。采用Excel绘制月份动态变化的柱形图，基于本地的代谢数据库对样本萜类代谢物进行定性分析。使用三重四级杆质谱，通过多反应监测模式(MRM)对样本萜类代谢物进行定量分析。采用Analyst 1.6.3软件处理质谱数据，采用MultiaQuant软件打开质谱文件，积分色谱峰面积并校正，得到萜类代谢物的相对含量[16]。

2 结果与分析

2.1 青钱柳总三萜含量月份动态变化及其与月份相关性分析

2.1.1青钱柳总三萜含量的月份动态变化规律 对4月至11月青钱柳总三萜定量分析，结果(图1)表明总三萜质量分数变化范围在3.96%～8.36%，呈“双峰型”的动态变化规律，单因素方差分析结果表明青钱柳总三萜质量分数在不同月份之间差异达到极显著水平(P<0.01)。6月(8.36%)、7月(7.63%)、10月(8.05%)总三萜质量分数高，5月(4.49%)、9月(4.71%)、11月(3.96%)总三萜质量分数低，方差分析结果表明6、7、10月总三萜质量分数极显著高于5、9、11月(P<0.01)。7月(7.63%)、8月(6.47%)、9月(4.71%)总三萜质量分数为下降趋势，方差分析结果表明7、8月总三萜质量分数差异达到显著水平(P<0.05)，8、9月总三萜质量分数差异达到极显著水平(P<0.01)。

注：图中不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)，不同大写字母表示差异达到极显著水平(P<0.01)

2.1.2青钱柳总三萜含量与月份的相关性分析 一元线性回归分析结果表明，青钱柳总三萜质量分数与月份间呈负相关关系(图2)。青钱柳总三萜质量分数与月份间的皮尔森相关性系数为-0.203，存在负相关关系。4月至11月青钱柳总三萜质量分数整体为下降的积累趋势。

图2 青钱柳总三萜质量分数与月份的相关性

2.2 10月青钱柳叶片的萜类物质成分分析

在青钱柳保健茶生产过程中，生产者通常在秋季采收青钱柳叶片，秋季的青钱柳叶片已成为生产青钱柳保健茶的主要原料。本研究结果表明，10月总三萜积累量高，因此决定分析10月青钱柳叶片的萜类代谢组。通过UPLC-MS/MS对10月青钱柳叶片萜类化合物进行定性定量分析，结果表明10月青钱柳叶片共检测到69种萜类化合物，其中三萜类化合物含量最高为83.02%，其次分别为三萜皂苷类为11.02%、二萜类为2.01%、倍萜类为1.40%、萜类为1.37%、倍半萜为1.18%(图3)。

图3 萜类代谢物的类别及占比

萜类物质中相对含量排名前10的物质为马达积雪草酸、坡模酸、常春藤皂苷元、2α-羟基熊果酸、11-酮基-熊果酸、α-香树脂酮、科罗索酸、山楂酸、青钱柳苷Ⅱ、Pterocaryoside B，其中大多数为三萜类化合物，少部分为三萜皂苷(表1)。本研究共检测到10种青钱柳苷类化合物，均属于三萜类，分别为青钱柳苷Ⅱ、青钱柳苷K、青钱柳苷F、青钱柳苷J、青钱柳苷A、青钱柳苷C、青钱柳苷H、青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷E、青钱柳苷Ⅲ，其中青钱柳苷I、青钱柳苷A均属于达玛烷型三萜皂苷是青钱柳甜味的主要来源。

表1 萜类代谢物成分及相对含量

续表1

3 结论与讨论

通过定量分析4月至11月青钱柳叶片总三萜，结果表明6月、10月总三萜积累量高，因此6月、10月为适宜的采收月份；青钱柳总三萜类物质呈“双峰型”动态变化规律，产生的原因可能是青钱柳内在的生长节律、基因表达动态等[17-18]，外在的土壤肥力、光照、温度、水分等[19-21]。4月至5月青钱柳刚结束休眠，次生代谢活动较弱[22-23]；6月营养生长期，总三萜积累量逐渐增加，SUN等[24]认为中国东南部低山丘陵的青钱柳人工种植区和天然群落可能会形成独有的小气候，在青钱柳生长期提供充足的水热条件从而有利于萜类物质的合成；7月至9月是夏季，青钱柳进入繁殖阶段，开花结果过程中可能逐渐消耗大量底物和中间体，只有少部分被用于萜类合成[25]；10月地上部分生物量高，然而气温逐渐下降，低温等胁迫因子可能使总三萜在叶片的积累逐渐增加[26-27]；11月进入冬季叶片变黄脱落，总三萜积累量最低。今后可以通过青钱柳代谢组及转录组联合分析，并结合环境因素进一步揭示萜类物质的积累变化规律[28-30]。

在青钱柳保健茶的生产过程中，生产者通常在秋季采收青钱柳叶片，此时青钱柳地上部分生物量高，活性物质积累多[31-32]，秋季的青钱柳叶片已成为生产青钱柳保健茶的主要原料，且本研究结果表明10月青钱柳总三萜积累量高，因此决定选取总三萜质量分数高的10月进一步研究萜类代谢组。本研究结果表明，10月青钱柳叶片共检测到69种萜类化合物，其中三萜类最多，少部分以倍半萜、单萜等形式存在。在萜类中相对含量排名前10的物质为马达积雪草酸、坡模酸、常春藤皂苷元、2α-羟基熊果酸、11-酮基-熊果酸、α-香树脂酮、科罗索酸、山楂酸、青钱柳苷Ⅱ、Pterocaryoside B。积雪草酸及其衍生物属于乌苏烷型三萜皂苷，在青钱柳萜类代谢组中含量最高，郭冰洁[33]研究表明积雪草酸能够抑制肝癌细胞增殖及转移，并诱导癌细胞凋亡；柳军等[34]研究表明积雪草酸能够增加肝细胞对外周葡萄糖的摄取，并改善糖代谢，因此在未来进一步开发青钱柳积雪草酸及其衍生物，对治疗糖尿病及癌症等具有重要意义。坡模酸属于乌苏烷型三萜皂苷，其含量仅次于积雪草酸，LEE等[35]研究表明坡模酸能够显著增加肌肉细胞对葡萄糖的摄取，在未来可以作为无毒副作用的胰岛素增敏剂。在青钱柳萜类化合物中科罗索酸、山楂酸含量相对较高，研究表明科罗索酸、山楂酸具有显著的抗糖尿病、抗氧化、抗炎症的作用[36]。青钱柳苷属于三萜类，本研究共检测到10种青钱柳苷类化合物，目前有7种被分离纯化[37-39]，青钱柳苷类化合物在提取、分离、鉴定方面虽有一定的基础，但其化学成分和结构与降血糖活性之间的关系尚未明确，因此今后对青钱柳苷类化合物降血糖活性进行深入的研究，对青钱柳药理活性的深度开发具有重要意义。青钱柳在民间常被作为甜茶饮用，青钱柳茶独特的甜味深受人们的欢迎，现代研究表明青钱柳三萜类物质是甜味的主要来源，舒任庚等[40]从青钱柳提取液中分离得到青钱柳苷I，并证实其具有强甜味；杨大坚等[41]从青钱柳提取液中分离得到青钱柳苷A，并证实其甜度超蔗糖的200倍。本研究检测到青钱柳苷I、青钱柳苷A均属于达玛烷型三萜皂苷，可以进一步开发这类天然的甜味物质。综上所述，青钱柳叶片中的萜类化合物在药物方面具有良好的降血糖、抗氧化等功效，在食品方面具有独特的风味，因此青钱柳叶片萜类成分的开发为功能性保健食品的市场及天然药物的研发提供广阔的前景。