通用型细胞冻存保护液的探索

吕玲，邢义高，张秀涛，雒猛，刘国军

·技术与方法·

通用型细胞冻存保护液的探索

吕玲，邢义高，张秀涛，雒猛，刘国军

250102 济南，山东省齐鲁干细胞工程有限公司

在过去十年中，我国在细胞治疗领域制定了一系列重要的政策和法规[1-3]，政策的支持使得包括干细胞和免疫细胞治疗在内的细胞治疗领域的发展进入快车道。然而细胞制品不同于其他制品，细胞需要具备高效的生物活性才能发挥其独特的治疗功能。目前临床应用的细胞产品分为新鲜细胞和冻存细胞，新鲜细胞存在一定的检测结果延滞和保存时间短的缺点，冻存细胞产品具有细菌、病毒等各类检测数据完整，细胞特性稳定等优势，冻存细胞产品势必成为未来干细胞和免疫细胞等细胞治疗[4]的主流产品。

冻存细胞产品的有效性和稳定性主要取决于冻存保护液[5]，目前细胞冻存保护液中往往含有胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、自体血浆或（minimum essential medium，MEM）培养基等[6]，这些成分大大限制了冻存细胞产品的临床应用。本实验旨在优化冻存保护液的成分，探索一种无动物源的可直接临床注射级别的通用型细胞冻存保护液，为进一步的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 脐血样本由山东省脐血库提供，异体脐带由山东省细胞组织库提供，均具备捐献者的知情同意书。

1.1.2 主要试剂 0.9% 氯化钠注射液和 5% 复方氨基酸注射液均购自辰欣药业；20% 人血白蛋白购自 Baxter；DMSO（CE 认证 USP 级冻存液）购自美国 OriGen BioMedical；小儿电解质补给注射液和 6% 右旋糖酐 40 葡萄糖注射液均购自石家庄四药有限公司；6% 羟乙基淀粉购自山东华鲁制药有限公司；CD34、CD44、CD45、CD90、CD3、CD56 等单克隆抗体购自美国 BD 公司；BI 冻存保护液购自以色列 Biological Industries。

1.1.3 仪器 二氧化碳培养箱为 Heal Force 公司产品；离心机为美国赛默飞产品；生物安全柜为苏净安泰公司产品；流式细胞仪为美国 BD 公司产品；细胞计数仪为 Countstar 公司产品；五分类血细胞计数仪为日本希森美康公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞冻存保护液的配制 按照体积比配制不同的细胞冻存保护液，冻存保护液 A：80% 自体血浆 + 10% 二甲基亚砜（DMSO）+ 10% 右旋糖酐；冻存保护液 B：10% 人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）+ 10% 右旋糖酐 + 10% 复方氨基酸 + 10% DMSO + 60% 小儿电解质补给注射液；冻存保护液 C：70% 羟乙基淀粉 + 20% HSA + 10% DMSO；冻存保护液 D：Biological Industries（BI）的冻存保护液。

1.2.2 脐血单个核细胞（MNC）的分离、冻存 将全血离心后取血浆配制细胞冻存保护液 A，用生理盐水 1:1 稀释血细胞沉淀过 Ficoll 离心，吸取白膜层，洗涤离心，取离心的上清液进行细菌内毒素、真菌、支原体及细菌检测，取样测定细胞数量和表型，用细胞冻存保护液 A 和 B 按5 × 107/ml 浓度分别进行冻存，将细胞放入程序降温盒移至–80 ℃冰箱，过夜转移至液氮，冻存 3 个月。

1.2.3 脐血自然杀伤细胞（NK）的培养、冻存 将分离提取的脐血单个核细胞，取适量细胞用于培养 NK，加入一支滋养层细胞 A1+ 5% 自体灭活血浆，培养 3 d 后换液，第 3 天至第7 天观察补液，第 8 天加入滋养层 A2，继续培养至第 14 天进行取样，测定细胞数量和表型，利用细胞冻存保护液 B 和 C 按 5 × 107/ml 浓度分别进行冻存，将细胞放入程序降温盒移至–80 ℃冰箱，过夜转移至液氮，冻存 3 个月。

1.2.4 脐带间充质干细胞（MSC）的分离、培养、冻存 用含青霉素和链霉素的生理盐水洗涤脐带，取出华通氏胶剪碎至 1 mm3大小，悬贴于含有培养基的培养瓶中，37 ℃培养箱静置 7 d 后半量换液，待细胞融合达到 80% 时，传代接种 P1；当 P1 代细胞融合达 90% 以上时收获；取样测定细胞数量和表型，取细胞离心的上清液进行细菌内毒素、真菌、支原体及细菌检测，利用 BI 冻存保护液和细胞冻存保护液B 按 5 × 106/ml 浓度进行冻存，将细胞放入程序降温盒移至–80 ℃冰箱，过夜转移至液氮，冻存 3 个月。

1.2.5 细胞复苏 液氮冻存 3 个月后将细胞取出，37 ℃水浴锅中快速溶解后，将细胞悬液加入备好的缓冲溶液（含 1% 人血白蛋白的生理盐水），混匀后取出 1 ml 细胞悬液至 EP 管中进行流式检测细胞活率、表型，剩余细胞悬液 300 ×离心 10 min，弃上清，加入缓冲溶液重悬，混匀取样，MNC、NK 细胞用五分类血细胞计数仪计数；脐带间充质干细胞用台盼蓝染色后 Countstar 计数；MNC 细胞进行 CFU 接种，1 × 104/孔，每组细胞重复接种两次，放置于 37 ℃、5% CO2孵箱中培养2 周，记录实验结果；MSC 细胞进行贴壁培养，2 × 106/瓶接种，于 37 ℃、5% CO2孵箱中静置 4 h 后，进行消化计数，计算贴壁率。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同细胞冻存保护液对脐血 MNC 细胞复苏的影响

由表 1 可知冻存保护液 A 的细胞活率为（86.66 ± 6.75）%，冻存保护液 B 的细胞活率为（82.47 ± 2.41）%，两种冻存保护液之间细胞表型的结果近似，冻存保护液 B 的 CFU 结果高于冻存保护液 A，冻存保护液 A 离心后的细胞数量要高于冻存保护液 B，但是两种冻存保护液的活率、表型、CFU 和离心后的细胞数量之间的比较无显著性差异（> 0.05）。

2.2 不同细胞冻存保护液对脐血 NK 细胞复苏的影响

表 2 数据表明，B、C 两种冻存保护液对 NK 细胞复苏后的效果相似，其中就离心后的细胞数量而言，冻存保护液 B 的活率要高于冻存保护液 C，但是两组之间无显著性差异（> 0.05）。

2.3 不同细胞冻存保护液对 MSC 细胞复苏的影响

由表 3 的活率和细胞表型结果可知，B、D 两种冻存保护液对间充质干细胞复苏后的效果相似，冻存保护液 D 的贴壁率要高于冻存保护液 B，但由检验分析可知，两种冻存保护液的活率、表型、贴壁率之间的比较无显著性差异（> 0.05）。

3 讨论

脐血单个核细胞、脐血 NK 细胞和脐带间充质干细胞[7-9]是具有代表性和广泛临床应用前景的多功能干细胞，需求量大。目前上述三类干细胞的商品化的冻存保护液产品琳琅满目，往往一种干细胞，就存在多种与之对应的冻存保护液产品。但是这些干细胞冻存保护液价格昂贵，并且能否应用于临床研究尚不明确，大大阻碍了干细胞在治疗领域的发展，因此探索一种无动物源成分并且可直接临床注射级别的通用型细胞冻存保护液，是干细胞产品进一步临床应用的重要基础。

干细胞冻存保护液方案的优化主要来自于两个方面的挑战：①冻存保护液的组成成分会不会降低干细胞复苏后的活力和功能；②安全问题。陈露萍等[10]研究发现冻存保护液中 50% FBS 可使人 iPSC 的冻存复苏效率最优并保持较好的生物学特性；王雨琪等[11]通过实验证明 FBS:DMSO 为 9:1 的比例应用于悬浮细胞的短期冻存与培养的效果最好；黄馨萍等[12]通过实验证明当冻存保护液中自体血浆:DMSO = 9:1 时，脐血单个核细胞的冻存效果最佳；Ray 等[13]开发了一种无血清无 DMSO 的冻存保护液，以 0.9% NaCl 为载体，加入 10% 聚乙烯吡咯烷酮和 60 mmol/L 四氢甲基嘧啶羧酸时，人脂肪来源的间充质干细胞的冻存复苏后的活率高达 81%；吕小婷等[14]使用 FBS:DMSO = 9:1 的比例冻存 NK 细胞，实验证明 12 周以内对 NK 细胞的功能及杀伤活性没有影响。

由于胎牛血清存在病原体传播和免疫反应的潜在风险，临床使用非常不可取；DMSO 作为一种常见的冻存保护剂，研究表明可无需洗涤直接进行临床注射[15-16]，本研究中的细胞冷冻保护液除含有常见的 DMSO 外，其余有效成分 HSA、右旋糖酐、复方氨基酸、小儿电解质补给注射液均为符合国家标准的临床药物，既是冻存保护液也是注射液，保证细胞质量同时保证辅料的临床级别。自体血浆和 DMSO 的混合液作为脐血单个核细胞对照冻存保护液，液氮冻存3 个月后复苏检测，结果表明两种冻存保护液的活率、表型、CFU 和离心后的细胞数量之间的比较无显著性差异（> 0.05）；羟乙基淀粉与人血白蛋白组成的冻存保护液[17]作为脐血 NK 细胞对照冻存保护液，实验结果说明，该两种冻存保护液均具有良好的冻存效果；选用 BI 的商品化冻存保护液作为脐带间充质干细胞的对照冻存保护液，实验结果说明 BI 冻存保护液的贴壁率略高于通用型细胞冻存保护液，但是这两种冻存保护液的活率、表型、贴壁率之间的比较无显著性差异（> 0.05）。

表1 A和 B 两种冻存保护液对脐血单个核细胞复苏的影响（n = 6）

冻存保护液活率（%）CD34+（%）CFU离心后细胞数量（× 107） A86.66 ± 6.750.27 ± 0.0914.2 ± 3.54.33 ± 0.33 B82.47 ± 2.410.32 ± 0.0518.8 ± 4.34.12 ± 0.12 P 值0.1500.3920.2850.218

表2 B 和 C 两种冻存保护液对 NK 细胞复苏的影响（n = 4）

冻存保护液活率（%）CD3+CD56+（%）离心后细胞数量（× 107） B89.01 ± 1.8090.03 ± 5.834.54 ± 0.35 C88.92 ± 0.9891.24 ± 4.854.80 ± 0.11 P 值0.2820.3140.101

表3 B 和 D 两种冻存保护液对 MSC 细胞复苏的影响（n = 6）

冻存保护液活率（%）细胞表型贴壁率（%） CD34+CD44+CD45+CD90+ B90.56 ± 2.330.01 ± 0.0098.49 ± 0.980.20 ± 0.1599.91 ± 0.0453.97 ± 8.42 D90.85 ± 2.430.03 ± 0.0199.61 ± 0.300.19 ± 0.0899.71 ± 0.2163.27 ± 8.83 P 值0.8800.0830.1540.3520.0210.929

目前的数据比较基础，但在一定程度上可以反映该通用型细胞冻存保护液的冻存效果，该冻存保护液可有效冻存脐血单个核细胞、脐血 NK 细胞和脐带间充质干细胞，做到一液多用；并在确保临床使用的基础上进一步减少后续药物申报时冻存辅料的验证工作。但其有效性和安全性还需要更多的实验数据，并在此基础上进一步开展相关研究和临床试验。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.04.009

吕玲，Email：404273712@qq.com

2021-11-09