单纯餐后高血糖症的非靶向代谢组学研究

娜孜热木·夏甫开提 孙 威 杨 蕾 沈 静 肖 辉

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是全世界高发的疾病之一[1]。国际糖尿病联合会 (International Diabetes Federation，IDF) 数据显示，2019年全球糖尿病患者约为4.63亿，预计2045年全球总患病人数将达到7亿[2]。单纯餐后高血糖症 (isolated post-challenge hyperglycaemia,IPH)主要表现为空腹血糖(fasting plasmaglucose,FPG)<7.0mmol/L而2h餐后血糖(2h-PG)≥11.1mmol/L[3]。研究表明,我国糖尿病患者经口服糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)诊断的新发糖尿病患者中，有46.6%的患者仅表现为单纯餐后血糖水平升高而空腹血糖水平处于正常，漏诊率达60.7%[4]。本研究利用非靶向代谢组学方法，试图找到IPH患者空腹血清中的特征标志物，从而降低漏诊率，达到早发现、早干预治疗的重要现实意义。

对象与方法

1.研究对象：选择2020年9月11日～2021年1月31日期间于乌鲁木齐友谊医院体检的374例受检者，根据研究目的分为餐后高血糖病例组(IPH组)、2型糖尿病组(T2DM组)和正常对照组。经性别、年龄基线资料匹配后，确定每组研究对象为20例。

2.纳入与排除标准：纳入标准：①年龄35～65岁；②长期(≥5年)居住于乌鲁木齐市；③符合相关组入组分类标准，T2DM组诊断标准：空腹血糖浓度≥7.0mmol/L(空腹的定义为至少8h未摄入能量)，OGTT试验2h血糖≥11.1mmo1/L(依照WHO推荐的执行方法，将75g无水葡萄糖溶于水中作为糖负荷)；IPH组诊断标准：空腹血糖浓度<7.0mmol/L 和2h餐后血糖浓度≥11.1mmo1/L；正常糖耐量即空腹血糖和2h餐后血糖均为正常。排除标准:①有严重肝脏、肾脏疾病；②患高血压、遗传病、冠心病等疾病；2型糖尿病及高血糖病情不稳定患者；③服用对试验研究目的有潜在影响的药物者。

3.临床采集与保存：血样采集12h空腹血液，采用一次性真空负压采血管抽取肘静脉血10ml均放于真空管中。取5ml血样静置30min后，4℃ 3000r/min离心10min，取离心后的血清于-80℃冻存。

4.仪器与试剂：LC20超高效液相色谱仪购自日本Shimadzu公司；TripleTOF-6600质谱仪购自美国AB Sciex公司；涡旋混合器MIX-200购自上海净信实业发展有限公司；离心机5427R购自德国Eppendorf公司；乙腈、甲醇、甲酸、2-氯苯丙氨酸购自美国Thermo Fisher公司。

5.样品前处理与色谱与质谱条件及进样方式：取样本100μmol加入到对应的已编号的1.5ml离心管中，加入300μl纯甲醇(含1ppm的2-氯苯丙氨酸)。涡旋2min，放入-20℃冰箱孵育0.5h。涡旋2min，12000r/min、4℃条件下离心10min；取200μl上清液转移至新的1.5ml离心管中,-20℃静置0.5h。再将上清液在12000r/min、4℃条件下离心15min。取上清液于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。色谱柱：Waters T3 C18柱，内径2.1mm×100mm, 1.8μm(C18 MWM-13)；流动相A: 0.04%乙酸/水；流动相B: 0.04%乙酸/乙腈；仪器柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl。

结 果

1.研究对象的临床特征：3组研究对象在性别、年龄、总胆固醇、低密度脂蛋白水平方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。然而在体重指数、甘油三酯、高密度脂蛋白和糖化血红蛋白水平方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)。3组临床基线资料的比较详见表1。

表1 3组研究对象临床基线资料比较

2.代谢组学结果：通过对3组样本进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，结果显示各代谢组间有分离趋势，提示样本代谢组存在差异。为了得到更好的组间差异效果投影图，进行监督性多元统计分析方法，即偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)。与PCA比较，OPLS-DA可以使组间区分最大化，有利于寻找3组差异代谢物。从OPLS-DA分析结果发现，Q2=0.634,R2X=0.224，R2Y=0.995，是一个有效模型3组比较得到了明显的分离趋势(图1)。基于OPLS-DA结果，获得模型的变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)，通过选取VIP≥1可以初步筛选出不同组间差异的代谢物。同时可以结合单变量分析的P<0.05和差异倍数值(fold change,FC)FC≥2 和FC≤0.5 的代谢物来筛选出可能潜在的标志物，本研究通过S-plot，发现3组样本都有明显的差异代谢物(图2)。

图1 OPLS-DA散点得分图

图2 3组差异代谢物绘制S-plot图

3.差异代谢物的筛选结果：正负离子模式下，血清样本筛选出的差异化合物与PubChem、HMDB数据库进行比较,3组样本通过非靶向代谢组学方法共鉴定出1205个差异代谢物质, 包括脂类与类脂分子(28%)、有机酸(9%)、有机氮化合物(11%)、苯类化合物(11%)及其他代谢物；其中IPH组与T2DM组和正常对照组比较，分别得到24个和254个显著差异代谢物，表2展示各组前10个显著差异代谢物。

表2 差异代谢物筛选结果(前10项)

4.差异代谢物代谢途径富集分析:正负离子模式下，根据差异代谢物结果进行KEGG通路富集分析，通过差异表达的代谢物中在对应通路中的个数与该通路检测注释到的代谢物总数的比值富集因子(rich factor)来表达富集程度，该值越大表示富集程度越大；同时观察富集显著性(P)值，其越接近于0，表示富集越显著。3组的差异代谢物在94条KEGG通路中富集，其中在7条通路显著富集(P≤0.05)，这些通路为2-氧代羧酸的代谢、氰胺酸代谢、谷胱甘肽的代谢、氨基酸的生物合成、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸的降解、托烷、哌啶和吡啶类生物碱的生物合成和牛磺酸和次牛磺酸的代谢途径；IPH组与T2DM组差异代谢物在初级胆汁酸的生物合成和胆汁酸的分泌代谢通路中显著富集(P≤0.05，图3A)；与正常对照组差异代谢物则在9条代谢通路富集(图3B)。

图3 差异代谢物KEGG富集图A.IPH组与T2DM组差异代谢物；B.IPH组与正常对照组差异代谢物

讨 论

单纯餐后高血糖症属糖尿病早期的亚系，与心血管疾病风险增加相关[5,6]。目前研究者认为，糖代谢在糖调节受损和糖尿病阶段是存在较大的异质性，IPH可能是单纯糖耐量受损病情进一步加深的结果，处于这两种阶段的患者的病理机制和发病机制有所区别[7]。本研究利用目前较认可的代谢组学方法，试找到IPH患者区别性特征标志物。

此次研究中IPH患者占22.45%(84/374)，根据《中国成人血脂异常防治指南》标准，血脂异常的IPH患者检出率为27.38%(23/84),且血糖异常以高甘油三酯(TG)为主[8]。TG作为脂肪组织中的含量丰富的一种脂质，可影响糖、脂代谢[9]；当患者出现较高的TG水平时,就提示患者存在高血糖症可能性[10]。按照中国成年人体重指数参考值，此次调查中超重肥胖的IPH患者51.19%(43/84)，超重和肥胖是血脂异常的主要危险因素，也与诸多代谢紊乱性疾病发病密切相关[11]。TG水平与BMI受生活习惯、饮食、年龄等的影响。新疆地区居民的膳食结构总体上呈现高蛋白、高脂肪、低维生素(蔬菜、水果摄入单一)、低矿物质的膳食模式倾向，并存在季节性饮食结构差异[12]。本研究收集样本血清由9月(秋季)过渡到次年1月(冬季)，秋冬季寒冷且漫长，日照相对少，饮食中多热性、味重、油腻的食品，肉、乳的消费较高。此类季节饮食特点使体内的脂肪含量增加的同时TG水平也随之上升，从而可能增加餐后高血糖症的发生与发展。

本研究检测出的3组差异代谢物中占比最多为脂类和类脂分子(28%)。刘丽燕等[13]利用UPLC-Q-TOF-MS对IPH人群的血清进行代谢指纹图谱分析，发现的17种化合物中有13种为脂类化合物。Arneth等[14]在关注代谢组学脂质谱和糖尿病早期之间的关系研究上，发现在T2DM前期患者体内存在高浓度的低碳脂质，例如甘油磷脂和鞘磷脂。同样，本研究IPH组分别与T2DM组、正常对照组两两比较发现的脂类差异代谢物包括甘油磷脂、丙醇脂类、鞘脂类、脂肪酰基类和类固醇与类固醇衍生物，其中，两个比较组共有的高表达差异代谢物甘油磷脂包括的1，2-二乙酰甘油-3-磷酸(PA、PE)和低表达单甲基磷酸乙醇胺(PE-NMe)中，前者是三乙基甘油和磷脂生物合成中的中间体，后者是细胞脂质双层的关键成分。进一步来说，作为细胞膜主要组成成分的磷脂，与机体胰岛素敏感度相关；既往研究表明，红细胞膜磷脂高低变化与胰岛素抵抗有关[15]。本研究初步推测上述甘油磷脂类差异代谢物作为诊断IPH的生物学标志物具有一定的特异性。

3组研究对象差异代谢物中有7%为有机酸类化合物。在既往的研究中，该胆汁酸的水平紊乱与新发疾病呈正相关，并证实与T2DM前期发病有关[16]。笔者也发现，相对于T2DM组，存在于初级胆汁中胆烷酸类-去甲胆碱酸、次级胆汁酸-去氧胆酸是IPH高表达差异代谢物。Fall等[17]研究显示，上述两种胆汁酸都以胆固醇为原料在肝脏中合成，并且在脂类消化吸收过程调控糖脂及能量代谢中起关键信号分子作用。本研究结果提示，IPH患者体内该胆汁酸代谢物发生改变并且该代谢物在通路初级胆汁酸的生物合成和胆汁酸的分泌代谢中发生紊乱。

支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸是人体重要的必需氨基酸,参与机体多重代谢过程。既往研究发现，支链氨基酸与胰岛素抵抗密切相关，BCAAs分解代谢增加导致中间代谢物增加，潜在地导致受体应激和胰岛素分泌作用受损[18,19]。本研究发现，3组差异代谢物在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解代谢途径显著富集，另外还在2-氧化羧酸的代谢、谷胱甘肽代谢、牛磺酸和次牛磺酸的代谢、托烷、哌啶和吡啶类生物碱的生物合成代谢通路等多条代谢途径富集；这更加表明，与正常人群比较，IPH患者与T2DM患者机体多种代谢途径改变。除此之外，发现的谷氨酰胺、苯丙氨酸、L-苯丙氨酰，是IPH组与两组比较共有的差异代谢物。

在胰岛素抵抗动脉粥样硬化研究(IRAS)的参与者中，发现谷氨酰胺与谷氨酸的比率可以预测5年后的胰岛素抵抗。Wang等[20]利用代谢组学技术发现，甘氨酸水平是糖耐量受损重要的预测因子。在代谢组学与2型糖尿病Meta分析研究中，233项代谢组学研究中的甘氨酸代谢表明与糖耐量受损程度呈负相关,甘氨酸和谷氨酰胺分别与11%和15%的糖尿病发生风险降低相关[21]。还有关于谷氨酰胺的8项分析中，有3项报告了显著的反向关联[22,23]。同样，本研究中的该谷氨酰胺差异代谢物分别在IPH组与正常对照组的比较和T2DM组与正常对照组比较中出现，未在IPH组单独与T2DM组比较中出现。虽该谷氨酰胺能否作为判别IPH患者的标志物尚不明确。但可以表明，与正常人群比较,IPH患者与T2DM患者该差异代谢物发生改变。

综上所述，本实验通过研究对象空腹血清进行代谢组学探索性研究，发现区别IPH和正常对照组与区别T2DM和IPH的生物学标志物是相同的几种甘油磷脂类、去氧胆酸和胆酸以及氨基酸类，初步说明诊断IPH患者时该代谢物可以作为参考指标，并且该指标只利用了空腹血清检测，可以解决IPH患者漏诊现象。但关于本研究类似相关报道较少，结果重复性差。此外，本研究样本量小、采集的样本血清具有区域性,受生活方式、饮食习惯等因素影响，不能够完全做出关于IPH患者的代谢紊乱的结论性陈述,需要更多的试验研究结果来验证。在往后的深入研究中,笔者将会进一步增加样本量和统计指标,以期得到更好的实验内容和实验结论。