琐琐葡萄黄酮对APP/PS-1双转基因AD小鼠的作用研究

古力夏提·艾力 袁 芳 张 鹏 再娜甫古丽·买买提 肖 辉

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种慢性进行性中枢神经系统变性疾病，已成为公共卫生领域的重大问题[1]。据2019年《世界阿尔茨海默病报告》显示，全球AD患者人数已高达5000万，我国60岁以上人群中AD患病率达到5.5%[2]。AD以β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积形成的细胞外神经炎性斑块为主要病理特征，Aβ的生成与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)密切相关[3，4]。AD发病机制复杂，目前，AD相关的药物仅能缓解症状，无法完全治愈[5]。因此，越来越多的研究人员正在从中药及其有效成分出发，寻求有效、安全、易于服用的天然药物防治AD[6]。

琐琐葡萄既是食品又是被记载在《维吾尔药志》、《神农本草经》等医药典籍中的传统药材，具有补气血、利小便、强筋骨等功效，医用于治疗脾胃不和、头晕腰酸、神志不安等[7]。在动物实验及临床实验中发现含黄酮类化合物比较丰富的植物和水果具有修复损伤神经元细胞、增强记忆等功能[8]。黄酮作为琐琐葡萄的主要有效成分之一，本实验用APP/PS-1双转基因AD小鼠研究琐琐葡萄总黄酮(flavones fromVitisviniferaL.，VTF)对APP/PS-1双转基因AD小鼠行为学及海马CA1区 AD 相关性病理形态学变化，以期为临床研究提供相关依据。

材料与方法

1.药品和主要试剂：琐琐葡萄药材购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维吾尔药材市场，盐酸多奈哌齐购自上海源叶生物科技有限公司，兔抗APP、兔抗Aβ1～42购自英国Abcam公司，兔二步法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.主要仪器: 冷冻干燥箱购自美国Thermo公司，紫外分光光度计购自日本岛津公司，Morris水迷宫视频分析系统购自成都泰盟软件有限公司,NIKON正置研究级显微镜购自日本尼康公司。

3.琐琐葡萄黄酮的制备和测定: 琐琐葡萄95%乙醇回流提取，提取液减压浓缩至浸膏，以水混悬萃取后，上 AB-8 大孔树脂，洗脱馏分后减压浓缩，冷冻干燥，得棕黄色粉末即VTF。参照文献[9]方法制备标曲，得回归方程Y=9.4714X+0.0308，R2=0.999。精确称量VTF，平行制备5份，测吸光度(A)值，计算平均百分含量。

4.动物分组及给药：6月龄SPF级雄性APP/PS-1双转基因AD小鼠75只，同龄SPF级雄性C57BL/6对照组15只，购自启动子生物科技(北京)有限公司[生产许可证号：SCXK(浙)2019-0004，使用许可证：SYXK(新)2018-0003，伦理审批号：IACUC-20210507-07]。适应性饲养7天，APP/PS-1双转基因AD小鼠75只，随机分为5组，即模型组，阳性对照组(多奈哌齐组，0.7mg/kg)，VTF低、中、高剂量组(70、210、420mg/kg)。另取6月龄同背景SPF级C57BL/6小鼠15只为空白对照组。空白对照组和模型组小鼠给予0.5%CMC-Na(0.1ml/10g)灌胃；阳性对照组给予多奈哌齐溶液(0.7mg/kg)进行灌胃；VTF 高、中、低剂量组灌胃分别为 420、210、70mg/kg，连续给药8周。

5.Morris水迷宫实验：各组动物在给药 8周后，参照文献[10]方法进行 Morris水迷宫训练，分析小鼠寻找平台的潜伏期以及穿越有效区域的次数。

6.HE染色：行为学测试结束后，每组随机抽取6只小鼠，解剖取脑组织，经乙醇脱水、石蜡包埋后切片，染色，镜下观察脑组织切片。

7.免疫组化：切片脱蜡至水，抗原修复；山羊血清封闭20min；随后滴加一抗(1∶500)，4℃过夜；滴加二抗工作液；DAB 显色；苏木精复染；封片，显微镜下观察。

结 果

1.琐琐葡萄黄酮含量测定：得回归方程Y=9.4714X+0.0308，R2=0.999(图1)，测吸光度(A)值，计算平均百分含量，RSD值为0.33%(表1)。

图1 芦丁标准曲线

表1 琐琐葡萄总黄酮含量测定

2.Morris水迷宫实验：与空白对照组比较，模型组小鼠逃逸潜伏期显著延长(P<0.01，图2)；与模型组比较，VTF各剂量组逃逸潜伏期显著缩短(P<0.05，图2)。与空白对照组比较，模型组小鼠有效区域进入次数显著减少(P<0.01，图3)；与模型组比较，VTF低剂量和VTF中剂量有效区域进入次数显著增多(P<0.05，图3)； 说明VTF可以有效改善APP/PS-1双转基因AD小鼠认知能力。

图2 各组小鼠逃逸潜伏期的变化与空白对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.05, ##P<0.01

图3 各组小鼠有效区域进入次数与空白对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.05, ##P<0.01

3.VTF对小鼠海马CA1区神经元形态影响的组织病理学观察：光镜下可见，与空白对照组比较，模型组有大量有凋亡倾向的神经元细胞，细胞数量减少且松散不规则，细胞质萎缩有间隙。与模型组比较，VTF各剂量组及阳性对照组的海马神经元细胞大多较正常，排列较整齐紧密，着色均匀，核仁清晰，核固缩、染色减轻，可见损伤程度和范围有所减轻，表明VTF可以有效保护APP/PS-1双转基因AD小鼠大脑海马神经元细胞(图4)。

图4 各组小鼠海马CA1区染色结果(HE,×400)A.空白对照组；B.模型组；C.阳性对照组；D.VTF低剂量组；E.VTF中剂量组；F.VTF高剂量组

4.VTF 对小鼠海马组织CA1区 APP 代谢相关蛋白表达的影响：光学显微镜下可见，阳性细胞呈棕褐色。与空白对照组比较，模型组小鼠海马组织APP蛋白阳性细胞数较多、染色较深；与模型组比较，VTF各剂量组小鼠海马组织APP蛋白阳性细胞均有所减少，染色减弱，阳性神经元细胞散在分布。表明VTF可以下调APP/PS-1双转基因AD小鼠海马组织CA1区 APP 的表达，进而减少Aβ沉积，减缓AD的病程进展(图5)。

图5 各组小鼠海马组织CA1区 APP 代谢相关蛋白表达(IHC,×400)A.空白对照组；B.模型组；C.阳性对照组；D.VTF低剂量组；E.VTF中剂量组；F.VTF高剂量组

5.VTF 对小鼠海马组织CA1区 Aβ1～42蛋白表达的影响：与空白对照组比较，模型组小鼠海马CA1区棕黄色阳性产物明显增多，提示小鼠脑内Aβ1～42蛋白的表达量显著增加。与模型组比较，VTF各剂量组Aβ1～42蛋白的表达量减少，但是仍然有棕黄色阳性产物，表明VTF可以降低APP/PS-1双转基因AD小鼠海马组织CA1区 Aβ1～42的过表达(图6)。

图6 各组小鼠海马组织CA1区 Aβ1～42 代谢相关蛋白表达(IHC,×400)A.空白对照组；B.模型组；C.阳性对照组；D.VTF低剂量组；E.VTF中剂量组；F.VTF高剂量组

讨 论

大量研究证实，大脑中Aβ的过度产生是AD的核心原因[11]。APP通过淀粉样途径水解产生多肽Aβ，当Aβ产生与清除的平衡被打破时，大量Aβ在脑内蓄积，清除减慢，最终在脑内蓄积产生淀粉样斑块，引发AD[12]。研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、保护神经、促进学习记忆等作用[13, 14]。研究发现，长期服用黄酮类化合物可以通过削弱淀粉样蛋白生成途径来减少Aβ40～42的生成，从而改善APP/PS1双转基因AD小鼠的记忆缺陷[15]。前期研究发现，VTF也可以保护PC12 细胞不受 Aβ25～35诱导的神经元损伤的影响[16]。

海马体主要负责记忆和学习功能[17]。研究表明，其损伤可能导致小鼠学习记忆能力下降[18]。本研究行为学实验结果显示，与模型组比较，VTF各剂量组逃逸潜伏期时长显著减少，低剂量和中剂量组进入有效区域次数显著增多，提示VTF对APP/PS-1双转基因AD小鼠学习记忆能力的损害有积极的改善作用，尤其是VTF低、中剂量组能显著缓解，与既往报道黄酮类化合物有改善记忆和学习能力结果一致[19, 20]。AD病理特征主要为Aβ沉积形成老年斑，APP的异常生成促使Aβ数量增加[21]。楚晋等[22]研究表明，淫羊藿黄酮能够通过降低APP转基因小鼠脑内APP和BACE的表达来减少Aβ的产生和聚集, 从而延缓APP转基因小鼠大脑病理进程。本实验结果发现，VTF各剂量组海马神经元细胞大多数较正常，排列较规整紧密，胞核固缩浓染减轻；棕黄色阳性产物APP和Aβ1～42蛋白表达趋于减少，染色减弱，阳性神经元细胞散在分布，说明VTF能通过下调APP 蛋白表达水平从而减少 Aβ产生，改善神经元损伤。

综上所述，VTF可以有效改善APP/PS-1双转基因AD小鼠学习记忆能力，对APP/PS-1双转基因AD小鼠大脑的神经元细胞有较好的保护作用，可以减少APP和Aβ1～42在APP/PS-1双转基因AD小鼠脑内的过表达，对APP/PS-1双转基因AD小鼠具有较好的防治作用。本研究结果为进一步深入探讨VTF对APP/PS-1双转基因阿尔茨海默病小鼠神经保护作用的研究奠定基础，对于VTF活性成分改善神经元损伤的途径和机制，需在后续实验中进行深入探讨。