人牙源性iPSCs分化心肌细胞促进急性心肌梗死小鼠心肌修复的研究

谭小兵，王儒仙，吕美荣，孙显凤，吕娜英，戴青原△

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是世界范围内死亡的首要病因［1］。AMI时有超过1×109的心肌细胞（cardiomyocytes，CMs）死亡，导致不可逆性心肌损伤，治疗方式包括溶栓、冠状动脉介入、冠状动脉搭桥术等，晚期唯一选择是心脏移植，但常缺乏足够的移植器官，还有免疫排斥问题［2］，迫切需要新的治疗方法。近年来干细胞领域的进展为AMI 治疗提供了新的思路，尤其是诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。iPSCs 与胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的生物学性能相似，无伦理和免疫排斥问题，是组织再生的理想来源。牙源性组织取材方便，重编程效率高，已有将其成功诱导为iPSCs 的报道［3］。心肌再生修复可能需要干细胞、支架、组织工程和细胞因子或生长因子的联合应用［4］。研究证实干细胞可明显改善AMI后的心脏功能［5］，但人牙源性iPSCs-CMs 用于AMI 修复的研究较少。本研究将人牙源性iPSCs-CMs注射到AMI动物体内，评估其对受损心肌的修复效果，为AMI的干细胞治疗提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）由本课题组培养冻存，BALB/C雄性SPF级7周龄小鼠9 只，体质量20～23 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；4 周龄CB-17 SCID雄性SPF级小鼠，体质量18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006；α-MEM 培养基、0.5 mmol/L EDTA、胎牛血清、vitronectin、CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒购自美国Invitrogen，PSCeasy 人多潜能干细胞培养基、repro-easy 重编程培养基、CardioEasy 人心肌细胞分化试剂盒购自北京赛贝生物技术有限公司；Alexa Fluor488羊抗鼠IgG二抗购自美国Life，鼠抗人肌钙蛋白T（troponin T，TNNT-2）单克隆抗体购自美国Santa Cruz，鼠抗人α-辅肌动蛋白（α-actinin）单克隆抗体购自美国Sigma，HE 染色试剂盒购自北京华越洋生物，荧光显微镜购自德国Carl Zeiss，16 通道多导生理记录仪MP160购自美国BIOPAC，飞利浦超声诊断系统S8-3购自荷兰皇家飞利浦公司。

1.2 细胞重编程 常规复苏SCAP，完全培养液（α-MEM+10%胎牛血清+1%L-谷氨酰胺+1%青/链霉素）培养，取4×104个细胞重新铺板，按照文献［6］进行细胞重编程。细胞加入预先配制的KOS/hc-Myc/hKlf4 混合液，37 ℃恒温转染24 h，连续培养1 周。消化收集已转染的SCAP，重新铺板（vitronectin 包被），更换为repro-easy 重编程培养基，每日换液。克隆形成后十字法挑选进行传代培养，1 周可达到80%融合，EDTA传代扩增用于后续实验。

1.3 畸胎瘤实验 为检测获得的iPSCs体内多向分化潜能，iPSCs细胞生长至90%融合时消化，1 000 r/min离心5 min，收集沉淀。PBS 重悬后注射于CB-17 SCID 雄鼠皮下（1×107细胞/只），2～3个月成瘤后收集瘤体，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，石蜡包埋、切片，HE染色。

1.4 iPSCs心肌定向分化

1.4.1 诱导分化 根据生产商说明配制心肌分化完全培育基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液，平衡至室温。iPSCs 细胞生长至80%融合时吸去原液，PBS清洗，加入2 mL心肌分化Ⅰ液，48 h后吸去旧液，PBS清洗后加入心肌分化Ⅱ液；48 h后更换为心肌分化Ⅲ液，37 ℃、5%CO2培养箱持续培养，每48 h 更换培养液，直至观察到细胞搏动。

1.4.2 心肌细胞鉴定 收集搏动区域细胞，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100处理1 h，5%脱脂牛奶孵育2 h，TNNT-2（1∶200）和α-actinin（1∶200）一抗孵育，加入Alexa Fluor488二抗常温孵育，胞核DAPI染色，荧光显微镜观察拍照。

1.5 AMI受损心肌修复的动物实验

1.5.1 实验分组 9 只BALB/C 雄性小鼠按照随机数字表法分为正常组（不干预）、AMI 组（AMI 造模）和实验组（AMI 造模+iPSCs-CMs注射），每组3只。

1.5.2 AMI建模 小鼠局麻后颈部正中切口，22 G针穿入气管，连接人工呼吸机，左胸4～5 肋间进入胸腔，分离心包膜，于主动脉根部4～5 mm、肺动脉与左心耳间8-0缝线穿过冠状动脉左前降支结扎，远端呈现暗红色提示成功，逐层缝合胸腔，多导生理记录仪行心电图即刻描记。

1.5.3 细胞移植 收集人SCAP-iPSCs-CMs，PBS 重悬后制成细胞悬液，调整密度为2×107/mL，术后30 min将20 μL悬液注射到梗死心肌区域周围，关闭胸腔、逐层缝合。恢复自主呼吸后拔出插管，严密缝合，肌内注射20 000 U青霉素，单笼饲养。

1.5.4 心功能评估 术后第15天行超声心动图检查，记录左心室舒张末期内径（LVDd）、左心室收缩末期内径（LVDs）、左心室舒张末期容积（LEDV）、左心室收缩末期容积（LESV），计算左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。LVEF=（EDV-ESV）/EDV；LVFS=（LVDd-LVDs）/LVDd×100%。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.02 软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Games Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人SCAP-iPSCs 的鉴定 复苏培养的人SCAP呈典型的成纤维细胞样，重编程第18～20 天形成小的圆形克隆，第23天克隆逐渐成熟，边缘锐利、细胞大小基本一致，核浆比大，呈典型胚胎干细胞样克隆形态，提示细胞处于未分化状态，见图1A～C。SCID小鼠皮下注射iPSCs 8 周可形成明显肿瘤，HE 染色可见肿瘤包含内胚层、外胚层和中胚层组织，提示iPSCs细胞有良好分化潜能，见图1D～F。

2.2 iPSCs 分化心肌细胞的鉴定 iPSCs 心肌诱导分化1周左右聚集形成团簇，期间多数细胞死亡，第8 天可观察到细胞簇自主搏动，免疫荧光染色可见TNNT2和α-actinin表达阳性，见图2。

2.3 3 组小鼠心功能比较 冠状动脉结扎术建立AMI 小鼠模型，术中2 只小鼠死亡，均予以重新补充。术后即刻心电图描记可见高耸T 波和ST 段抬高，见图3A。超声心动图检查呈现典型的左心室重构特征，表现为左心室心腔扩大（LVDd 和LVDs 增加），左心室收缩能力减弱（LVEF 和LVFS 减小），提示AMI动物模型制备成功，见图3B～D。术后超声心动图检查显示，AMI 组LVEF 和LVFS 明显小于正常组，实验组LVEF 和LVFS 明显大于AMI 组，但均低于正常组，见图4。

3 讨论

Fig.1 Reprogramming process of human SCAP-iPSCs and teratoma assay图1 人SCAP-iPSCs重编程过程及畸胎瘤实验

Fig.2 Immunofluorescence staining of differentiated hiPSCs-CMs(×400)图2 人SCAP-iPSCs分化心肌细胞标志物免疫荧光染色（×400）

Fig.3 AMI model and echocardiography results after CMs injection of the three groups图3 AMI动物模型及细胞注射后3组超声心动图检查结果

Fig.4 Comparison of echocardiography results after CMs injection between the three groups图4 细胞注射后3组超声心动图检查结果比较

iPSCs重编程来源细胞获取方式多为有创性，人牙源性细胞来源于拔除牙齿或种植手术的废弃组织，取材方便、重编程效率高［7］。本研究采用的仙台病毒重编程系统不与目标细胞DNA结合，避免DNA插入突变和病毒再激活，同时采用无异源性动物成分的铺底液作为支持层，增加了iPS细胞的生物安全性。本研究采用的iPSCs心肌分化培养基成分明确、步骤简单高效，诱导分化得到的心肌细胞可自主搏动，且特异性表达心肌标志物TNNT-2和α-actinin，经纯化后TNNT-2 阳性细胞比例可超过90%（其余为未分化或分化中iPSCs），为后期动物实验提供了可靠的细胞来源。采用经典的冠状动脉左前降支结扎法构建的AMI 小鼠模型，实验小鼠术后2 只发生死亡，可能为胸腔缝合不严密导致气胸死亡。分化心肌细胞注射到动物梗死心肌周围发现可以明显促进小鼠超声指标的改善，证实人牙源性iPSCs分化心肌细胞可以明显促进AMI 时受损心肌的修复，为AMI的干细胞治疗提供了新的思路。

干细胞用于心血管疾病的治疗可分为几个阶段［8］。第一代细胞是成体来源，包括骨骼肌细胞、造血干细胞、MSCs等，心内膜注射效果最佳［9］，这也是本研究采取心内膜注射的原因。第二代是有心肌分化潜能的干细胞，包括心脏干/祖细胞、ESCs、iPSCs等。Menasché 等［10］首次将ESCs 植入重度心衰患者体内梗死区域附近，术后心功能显著改善，LVEF 增加了10%。但ESCs的致瘤性、免疫原性和伦理问题限制了其临床应用。

本研究结果发现，人牙源性iPSCs-CMs 注射后实验组小鼠的LVEF 和LVFS 均有明显改善，提示细胞注射对受损心肌的修复效果。Funakoshi 等［11］将人iPSCs-CMs 注射到AMI 裸鼠梗死区域周围，术后LVFS 明显改善，左心室梗死面积缩小，与本研究结果一致，但该研究采用拟胚小体法诱导形成心肌细胞，分化培养基成分复杂、步骤繁琐，诱导时间较长。本研究采用成分明确、操作简单的分化培养基，Ⅰ液推动iPSCs 向中胚层转化，Ⅱ液诱导形成心脏中胚层，Ⅲ液使心脏细胞成熟，最早第8天即发现有细胞搏动。Jiang 等［12］采用商品化人iPSCs-CMs 进行研究，得到相似结果。Shiba等［13］采用相同的方法对长尾猕猴AMI 模型进行实验后发现，术后也可明显促进受损心肌的收缩功能，但会发生室性心动过速。移植干细胞在受损心肌内发挥修复作用的可能机制：（1）移植干细胞直接分化为心肌细胞。（2）旁分泌效应促进周围心肌细胞的增殖。（3）激活内源性心肌干细胞。（4）促进移植细胞和宿主心肌细胞的融合［14］。

干细胞移植存留量直接影响治疗效果。Ye等［15］将人iPSCs-CMs、内皮细胞和平滑肌细胞与装载胰岛素样生长因子（IGF）微球的3D纤维蛋白贴片植入猪心肌梗死区域，结果发现移植细胞与宿主心肌融合产生有序肌节结构，可以改善左心室功能。Li 等［16］研发了一种包裹人iPSCs-CMs 的可注射性AuNP-透明质酸凝胶，移植到AMI 小鼠体内可明显促进心肌缝隙连接和心室电传导的再同步化，有利于心肌修复。干细胞治疗用于诱导心肌修复有巨大的临床应用前景，但需要解决以下几个问题：一是细胞的移植效率，可联合应用生物支架和三维细胞打印技术［17］。二是安全问题，主要包括肿瘤和心律失常的发生。本研究仅对人iPSCs-CMs标志物进行了分析，未将其电生理特性与成熟心肌细胞进行对比。本研究时间段未发现宿主体内肿瘤的发生，应进一步延长观察时间，确保临床应用的安全性。

综上所述，本研究发现人牙源性iPSCs分化心肌细胞局部注射可以明显改善AMI小鼠的左心室泵血功能和心肌收缩性能，为AMI 的干细胞治疗提供了新的依据。