CDCA8通过调控增殖促进前列腺癌发生的作用机制研究

2022-08-10任智星杨光华

天津医药 2022年8期

任智星，杨光华

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤。在世界范围内，PCa 发病率居男性所有恶性肿瘤的第2 位，仅次于肺癌［1］。在美国，PCa 的发病率居男性恶性肿瘤首位，病死率居第2位［2］。我国是前列腺癌发病率和病死率相对较低的国家之一，但近年来随着人均寿命的延长和疾病筛查手段的进步，PCa发病率呈持续快速增长趋势［3］。传统治疗手段如手术、雄激素剥夺疗法、放疗和化疗仅对早期PCa 有效，对进展期PCa 治疗效果较差。为改善进展期PCa 治疗效果，需不断探索新的治疗靶点。目前，采用免疫和靶向疗法治疗进展期肿瘤前景广阔。细胞分裂周期相关蛋白8（CDCA8）在人体组织中广泛表达，参与细胞分裂，为真核细胞内纺锤体和微管稳定所必需［4］。研究显示，CDCA8 过度表达于乳腺癌、肺癌和肝癌等恶性肿瘤中，且与肿瘤的生长及预后密切相关［5-7］。然而，分析CDCA8在PCa中作用的相关研究较少。本研究对PCa 中CDCA8 的表达和作用机制进行初步探讨，旨在为PCa 的治疗提供新靶标。

1 材料与方法

1.1 材料选取2018年1月—2020年12月因PCa在山西白求恩医院行根治性前列腺切除术的56 例患者的术后标本。纳入标准：术前评估原发肿瘤临床分期为T1～T3a，排除伴有骨转移或其他脏器转移。患者年龄55～76 岁，平均（66.66±2.38）岁。前列腺术后标本的使用均取得患者或直系亲属知情同意，获得本院伦理委员会的批准。人PCa细胞株（PC3和DU145）购自美国ATCC 细胞库。胎牛血清及RPMI 1640 培养基购自美国Gibco公司，兔抗CDCA8抗体、Ki67抗体、增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、蛋白激酶B（AKT）抗体、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抗体、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）抗体及鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自英国Abcam 公司，山羊抗兔或山羊抗鼠二抗购自武汉Proteintech 公司，lipofectamine 2000和TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司，FastStart SYBR®Green Master 购自德国罗氏公司，非蛋白变性细胞裂解液购自中国索莱宝公司，实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）引物和小干扰RNA（siRNA）序列购自苏州吉玛公司。细胞培养箱购自美国THERMO公司，qPCR仪和Western blot设备购自美国Bio-Rad公司。

1.2 生物信息学数据挖掘采用GEPIA 网站数据分析工具（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CDCA8）比较癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中PCa组织和GTEx（Genotype-Tissue Expression）数据库中正常前列腺组织中CDCA8 mRNA水平差异。将TCGA数据库中PCa组织的CDCA8 mRNA 表达测序数据由小到大排列，前50%患者定义为CDCA8 mRNA低表达组（n=248），后50%患者定义为CDCA8 mRNA 高表达组（n=248），随访期间出现PCa 复发定义为事件发生，比较2组患者的无病生存期（DFS）。

1.3 免疫组化检测CDCA8蛋白表达将前列腺术后石蜡块标本以4 μm厚度切片，经苏木精-伊红（HE）染色后由2名经验丰富的病理科医师再次予以明确PCa 组织和癌旁组织的病理学诊断。切片经抗原修复后，用2%的BSA封闭30 min，随后用兔抗CDCA8抗体（1∶400）孵育切片4 ℃过夜。室温下羊抗兔二抗（1∶500）孵育2 h，最后在显微镜观察下进行显色反应并适时终止，由2 名研究人员各自随机读取5 个高倍镜视野进行观察评分。细胞染色评分：0 分，＜5%细胞染色；1分，5%～24%细胞染色；2分，25%～49%细胞染色；3分，≥50%细胞染色。染色强度评分：0分（无或轻度染色）、1分（中度染色）和2 分（重度染色）。CDCA8 的表达水平用染色指数表示。染色指数=染色细胞评分×染色强度评分。根据每例患者PCa组织和癌旁组织的CDCA8染色指数分析CDCA8蛋白的表达差异。PCa组织染色指数为0～2的患者定义为CDCA8蛋白低表达组（25 例），PCa 组织染色指数为3、4 和6 的患者定义为CDCA8 蛋白高表达组（31 例），分析PCa 患者CDCA8表达水平与临床特征的关系。

1.4 临床资料收集收集患者总前列腺特异性抗原（tPSA）、Gleason 评分、T 分期、术后组织切缘情况。根据前列腺癌预后风险标准［8］，将tPSA 以10 μg/L 分界，＜10 μg/L 为低危，≥10 μg/L为中高危；Gleason评分以7分界，＜7分为低危，≥7分为中高危。

1.5 PCa 细胞培养和转染将PC3 和DU145 细胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。通过Lipofectamine 2000将siRNA转染到PC3和DU145细胞中用于沉默CDCA8基因，将细胞分为沉默组（Si-CDCA8组）和对照组（Si-NC 组）。siRNA 目标序列：5′-GGUUUGACUCAAGGGUCUUTTAAGACCCUUGAGUCAAACCTT-3′。

1.6 qPCR检测CDCA8 mRNA表达水平使用TRIzol试剂提取Si-CDCA8组及Si-NC组PCa细胞中总mRNA。通过UEIrisⅡRT-PCR系统将mRNA逆转录生成cDNA，然后进行qPCR反应，GAPDH 为内参。CDCA8 引物：上游5′-GAAGGGCAGTAGTCGGGTG-3′；下游5′-TCACGGTCGAAGTCTTTCAGA-3′。GAPDH引物：上游5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3′；下游5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3′。反应体系10 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 2 μL，FastStart SYBR®Green Master 5 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，45 个循环。实验重复3次。mRNA数据通过2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.7 细胞克隆形成实验检测PCa细胞增殖能力 6孔板中每孔大约接种1 000个PCa细胞，置于37 ℃5%CO2恒温箱中孵育。其中3孔接种Si-CDCA8组细胞，另3孔接种Si-NC组细胞。培养2周后，4%多聚甲醛固定细胞，0.2%的结晶紫溶液染色2 min。去离子水多次洗涤后晾干，使用Image J 软件计算2组细胞集落数，实验重复3次。

1.8 Western blot 检测PCa 细胞中CDCA8、PCNA、Ki67、p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平使用非蛋白变性细胞裂解液裂解PCa细胞，提取并测定总蛋白浓度。每泳道加入40 μg蛋白样品行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后将已分离的蛋白质转移到聚乙烯氟化物（PVDF）膜上。用脱脂牛奶封闭PVDF 膜2 h，目标蛋白CDCA8（1∶800）、PCNA（1∶1 000）、Ki67（1∶1 000）、p-PI3K（1∶3 000）、PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶2 000）、p-AKT（1∶5 000）一抗孵育PVDF 膜并在4 ℃冰箱中过夜，GAPDH（1∶5 000）作为内参。室温下用山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶3 000）孵育PVDF膜1 h。随后用ECL显影试剂曝光蛋白条带。Image J 软件用于定量分析蛋白相对表达量。蛋白相对表达量=目标蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.9 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，癌旁组织和癌组织组间比较采用配对样本t检验，相关性分析采用Pearson法。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较使用Wilcoxon 秩和检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用Pearsonχ2检验或连续校正χ2检验，相关性分析采用Spearman法。生存期比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCa 组织和正常前列腺组织中CDCA8 mRNA水平比较 TCGA数据库中PCa组织（n=496）CDCA8 mRNA 水平较GTEx 数据库中正常前列腺组织（n=152）升高［1.446（1.124，1.841）vs.0.791（0.621，1.030），Z=13.330，P＜0.01］。

2.2 PCa 患者CDCA8 mRNA 低表达组与高表达组DFS 比较 CDCA8 mRNA 高表达组患者预后更差，中位DFS为82.4个月，2组患者DFS差异有统计学意义（Log-rankχ2=16.830，P＜0.01），见图1。

Fig.1 Comparison of DFS between the CDCA8 mRNA high expression group and the CDCA8 mRNA low expression group图1 CDCA8 mRNA高表达组和低表达组DFS比较

2.3 PCa组织和癌旁组织CDCA8表达水平比较前列腺组织切片中，PCa 组织CDCA8 的蛋白表达水平明显高于癌旁组织［2.79±0.89vs.1.68±0.83，t=13.296，P＜0.01］，见图2、3。

Fig.2 The expression of CDCA8 in PCa tissues(immunohistochemical staining,left×100,right×200)图2 PCa组织中CDCA8的表达（免疫组化，左×100，右×200）

Fig.3 The expression of CDCA8 in paracancerous tissues(immunohistochemical staining,left×100,right×200)图3 前列腺癌旁组织中CDCA8的表达（免疫组化，左×100，右×200）

2.4 PCa 患者临床特征与CDCA8 蛋白表达相关性分析患者tPSA、Gleason 评分、T 分期和术后切缘情况与CDCA8 蛋白表达呈正相关（r分别为0.481、0.627、0.281和0.467，P＜0.01）。CDCA8蛋白高表达组tPSA≥10 μg/L、T3期、术后切缘阳性患者比例高于CDCA8蛋白低表达组（P＜0.05）。见表1。

2.5 Si-CDCA8组和Si-NC组CDCA8 mRNA及蛋白比较 qPCR 和Western blot 显示Si-CDCA8 组CDCA8 mRNA 和蛋白水平均明显低于Si-NC 组（P＜0.01），见表2，图4。

2.6 Si-CDCA8 组和Si-NC 组细胞增殖能力比较 Si-CDCA8 组细胞集落数减少，增殖能力减弱（P＜0.01），见表3，图5。

Tab.1 Clinicopathological characteristics and CDCA8 expression of PCa patients between the two groups表1 2组前列腺癌患者的临床特征和CDCA8组织表达情况比较

Tab.2 Comparison of CDCA8 mRNA and protein expression between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表2 Si-CDCA8组和Si-NC组CDCA8 mRNA及蛋白表达水平比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

Fig.4 Expression levels of CDCA8 proteins in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group图4 Si-CDCA8组和Si-NC组CDCA8蛋白表达水平

Tab.3 Comparison of cell colony number between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表3 Si-CDCA8组和Si-NC组细胞集落数比较（n=3，个/视野，±s）

＊＊P＜0.01。

2.7 Si-CDCA8 组和Si-NC 组Ki67 和PCNA 表达水平比较 Si-CDCA8 组Ki67 和PCNA 蛋白表达水平较Si-NC组明显降低（P＜0.01），见表4，图6。

Tab.4 Comparison of Ki67 and PCNA expression levels between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表4 Si-CDCA8组和Si-NC组Ki67和PCNA表达水平比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

Fig.5 The number of cell colonies in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group图5 Si-CDCA8组和Si-NC组细胞集落数

Fig.6 Expression levels of Ki67 and PCNA in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group图6 Si-CDCA8组和Si-NC组Ki67和PCNA表达水平

2.8 Si-CDCA8组和Si-NC组PI3K/AKT通路蛋白表达水平比较 Si-CDCA8组PI3K、p-PI3K、p-AKT 表达水平较Si-NC组降低（P＜0.01），见表5，图7。

3 讨论

CDCA8蛋白是染色体乘客复合物（CPC）成分之一，CPC 包含4 个成员：Aurora B、着丝粒中心蛋白、Survivin及CDCA8［9］。在胞质分裂过程中，CPC可以促进和调节中央纺锤体的形成，并决定细胞卵裂沟的位置［10］，在肿瘤细胞过度增殖中起重要作用。而CPC 与核小体的结合主要涉及CDCA8 介导的复杂机制［11］，因此CDCA8可能影响肿瘤发生。

Tab.5 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表5 Si-CDCA8组和Si-NC组PI3K/AKT通路蛋白表达水平比较（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

Fig.7 Expression levels of PI3K/AKT pathway protein in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group图7 Si-CDCA8组和Si-NC组PI3K/AKT通路蛋白表达水平

本研究通过对56 例患者PCa 术后组织进行免疫组化分析发现，CDCA8 在PCa 组织中的表达水平较癌旁组织升高，且CDCA8 蛋白表达水平与tPSA、Gleason评分、T分期和术后切缘情况呈正相关，高表达CDCA8的PCa患者具有较高的tPSA、Gleason评分和临床分期，术后更有可能出现手术切缘阳性，预后较差。另外，TCGA 和GTEx 数据库中的测序数据也表明CDCA8 mRNA 水平在PCa 组织中较正常前列腺组织中更高，进一步证实CDCA8在PCa 发生及进展中的促癌作用。鉴于CDCA8 蛋白主要参与真核细胞有丝分裂，笔者推测CDCA8可能是PCa 发生的一个触发因素，并作为癌基因参与多种恶性肿瘤的进展。研究显示，CDCA8的过度表达与肝细胞癌患者的低生存率显著相关；在肝癌细胞中，沉默CDCA8 可抑制细胞周期蛋白B1 和磷酸化的细胞分裂周期蛋白2 的表达，并诱导G2/M 期细胞阻滞［5］。CDCA8是影响乳腺癌细胞增殖的关键因素［6］。另有研究表明，CDCA8的过度表达可促进黑色素瘤的进展，且与其不良预后相关［12］。与相对应的癌旁正常组织相比，CDCA8在肺癌组织中表达上调［7］。CDCA8显著促进骨肉瘤细胞的增殖［13］，其在癌症组织中表达上调，而在正常组织中低表达［14-15］。因此，CDCA8基因在调节细胞生长、分化和凋亡等过程中起重要作用［9，16］。本研究结果显示CDCA8在前列腺癌细胞过度增殖中起促进作用，与上述各项研究基本一致。

PCNA蛋白主要定位于细胞核，在细胞周期S期大量表达，参与多种恶性肿瘤的发生和发展，其表达水平与细胞增殖水平一致，可用于评估细胞增殖和侵袭能力［17］。Ki67是一种细胞增殖核抗原，用来标记处于增殖周期中的细胞，常作为肿瘤细胞增殖活性的标记［18］。本研究中，沉默CDCA8 基因后，PCa细胞的增殖能力受到限制，且细胞内Ki67 和PCNA蛋白含量也随之下降，表明CDCA8 基因可以调控PCa 细胞增殖。周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂1（P21/CDKN1A）是细胞增殖的抑制因子，它可与PCNA 竞争结合抑制DNA 的合成，从而影响细胞增殖和分化；沉默CDCA8 后P21/CDKN1A 蛋白表达上调，PCNA 蛋白表达下调，细胞周期停滞于G2/M期［19］。P21主要受P53调控，参与DNA损伤修复、细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学过程，与PI3K/AKT 信号通路关系密切。PI3K/AKT 信号通路参与真核细胞多种生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡、周期、耐药等，是细胞内信号转导的一条重要通路［20］。本研究中，沉默CDCA8 基因后，PCa 细胞内p-PI3K、p-AKT 表达水平下调，表明CDCA8 基因可上调PI3K 和AKT 的磷酸化水平，激活PI3K/AKT 信号通路。E2F 转录因子1（E2F1）是细胞核内一类重要的转录因子，以细胞周期依赖的方式调节细胞增殖。Cui 等［21］研究发现沉默肝癌细胞CDCA8 基因后，PCNA 和E2F1 表达降低，肝癌细胞增殖力减弱。故推测CDCA8 可能通过调节细胞增殖而参与PCa的发生，但具体分子机制仍需进一步深入研究。

综上，本研究发现CDCA8 在人PCa 组织中表达上调，且CDCA8蛋白表达水平越高，PCa患者肿瘤分期越高，预后越差。此外，CDCA8 高表达能够促进PCa细胞增殖，CDCA8通过PI3K/AKT信号通路调控细胞增殖，参与前列腺肿瘤的发生，是PCa治疗的潜在靶基因。