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FUNDC1通过调控线粒体分裂影响高糖损伤H9c2心肌细胞凋亡的机制研究

2022-08-10郑君毅张莹莹刘园园陈孟英郭绪昆

天津医药 2022年8期
关键词:培养液高糖存活率

郑君毅,张莹莹,刘园园,陈孟英,郭绪昆

糖尿病性心脏病是糖尿病患者的严重并发症,高血糖引起心肌细胞线粒体功能障碍,从而引发心力衰竭甚至死亡[1]。线粒体供给心脏能量,处于代谢和细胞凋亡的中心地位[2]。因此维持线粒体功能和结构的完整性对心肌细胞非常重要。线粒体是一个动态变化的细胞器,经历持续的融合和分裂过程,以维持其形态和生物学功能[3-5]。线粒体融合主要由视神经萎缩1(OPA1)和融合蛋白(MFN)调节。线粒体分裂由动力相关蛋白1(DRP1)触发,并与线粒体分裂蛋白1(FIS1)相互作用、共同调控。线粒体过度分裂和融合减少与线粒体功能降低有关[6-7]。DRP1 和FIS1 不仅是调控线粒体分裂的2 个关键蛋白,而且是诱导细胞凋亡的必需蛋白。FUNDC1 是近年发现的一个位于线粒体外膜的受体蛋白,具有高度的保守性[8]。其在高糖环境损伤的原代心肌细胞中呈高表达,并通过与内质网蛋白的相互作用,促进线粒体相关内质网膜(MAM)的形成,引起线粒体功能障碍[1]。但是,FUNDC1能否调节高糖损伤的心肌细胞线粒体分裂和细胞凋亡,目前尚不清楚。本研究尝试通过建立H9c2 心肌细胞高糖损伤模型来观察FUNDC1 表达变化,及其与线粒体分裂和凋亡的关系,阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 H9c2 心肌细胞购自中国科学院细胞库。DMEM培养液、减血清培养基(Opti-MEM)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青链霉素、转染试剂Lipofectamine 3000、线粒体提取试剂盒、蛋白Marker 和ECL 化学发光试剂盒均购自Thermo Fisher 公司。MTT、葡萄糖和二甲基亚砜(DMSO)购自Merck公司。乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。兔源FUNDC1一抗购自Abgent公司。兔源FIS1、B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)一抗,小鼠源GAPDH一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗均购自Proteintech 公司。兔源DRP1 和活化的胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)一抗购自CST 公司。线粒体红色荧光探针(DsRed-Mito)、FUNDC1 干扰质粒(shRNA-FUNDC1)和对照质粒(shRNA-NC)购自汉恒生物有限公司。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(AICAR)购自Selleck 公司。RIPA 蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白浓度检测试剂盒、含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封片剂和蛋白上样缓冲液购自索莱宝公司。

1.2 H9c2 心肌细胞培养和高糖损伤模型建立 H9c2 心肌细胞接种于含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM 完全培养液中,于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。每2~3 d传代1次。为建立高糖损伤的细胞模型,在完全培养液(含5.5 mmol/L葡萄糖)中加入葡萄糖至终浓度33 mmol/L,培养细胞48 h。

1.3 细胞转染 按照试剂盒说明书,在转染前将各组生长状态良好的细胞铺于6 孔板中,按照Lipofectamin 3000 的说明书将Opti-MEM培养基稀释后的shRNA-FUNDC1或shRNANC 分别与Lipofectamine 3000 混合,将混合液室温孵育10~15 min 后加入各组细胞培养液中,混匀后置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养8 h,然后更换为完全培养液,加高糖刺激48 h后收集各组细胞。细胞分为正常对照组(CTRL 组)、高糖组(HG 组)、HG+shRNA-NC 组(转染shRNA-NC 的HG 组细胞)、HG+shRNA-FUNDC1组(转染shRNA-FUNDC1的HG组细胞)和HG+AICAR 组(HG 组细胞使用AMPK 激活剂AICAR,1 mmol/L)。

1.4 MTT法检测各组心肌细胞的存活率 模型建立完成后,向各组细胞中加入20 μL MTT(5 g/L),37 ℃孵育4 h。轻轻吸净各孔液体,加入150 μL DMSO,置于水平摇床上使结晶充分溶解。待结晶完全溶解后,于490 nm波长下测定各孔吸光度(A)值。细胞存活率(%)=实验组A值/CTRL组A值×100%。

1.5 细胞LDH 释放量检测 吸取各组细胞培养液,按照LDH检测试剂盒说明书加入检测液后室温孵育30 min,在酶标仪上测定各组490 nm波长处的A值,计算LDH的释放量。

1.6 共聚焦显微镜观察线粒体结构 细胞接种在含细胞爬片的24孔板中,用DsRed-Mito特异性标记线粒体48 h后,吸干细胞培养液,用PBS 漂洗3 次,4%多聚甲醛室温下固定细胞15 min。PBS 漂洗3 次后加入含有DAPI 的封片剂进行封片,激光共聚焦显微镜下观察线粒体的结构。

1.7 Western blot 法检测蛋白的表达 按照线粒体提取试剂盒说明书操作,分离得到各组细胞线粒体沉淀和上清液,用RIPA裂解后提取各组线粒体蛋白、胞浆蛋白和细胞总蛋白。BCA 法进行蛋白定量。检测线粒体DRP1(DRP1-mito)和胞浆DRP1(DRP1-cyto)蛋白表达水平时,分别将线粒体蛋白和胞浆蛋白进行SDS-PAGE。检测其他蛋白表达水平,将总蛋白进行SDS-PAGE。根据蛋白Marker的分子质量大小,切取包含目的蛋白条带的凝胶,进行转膜,转膜条件为:4 ℃,110 V,90 min。将PVDF 膜放入5%BSA 中室温封闭2 h 后,分别加入抗FUNDC1、FIS1、DRP1、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)一抗,4 ℃孵育过夜。TBST 洗3次后,加入HRP标记二抗(1∶10 000),室温孵育1 h。再次用TBST 洗3 次,按照ECL 化学发光试剂盒说明书操作,用凝胶成像系统扫描后分析蛋白表达水平。实验重复3次。

1.8 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行数据处理。计量资料均以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

Tab.1 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表1 各组细胞存活率和LDH释放量对比 (±s)

Tab.1 Comparison of cell viability and LDH release between the four groups表1 各组细胞存活率和LDH释放量对比 (±s)

*P<0.05;a与CTRL组比较,b与HG组比较,P<0.05。

2 结果

2.1 各组细胞存活率和LDH 释放量的比较 与CTRL 组比较,HG 组细胞存活率降低,LDH 释放量升高(P<0.05)。与HG组比较,HG+shRNAFUNDC1 组细胞存活率升高,LDH 释放量降低(P<0.05);HG+shRNA-NC 组细胞存活率和LDH 释放量差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 各组细胞线粒体结构变化 CTRL组细胞线粒体呈线状结构,HG组和HG+shRNA-NC组细胞线粒体多呈点状结构;与HG 组比较,HG+shRNAFUNDC1 组线粒体线状结构增多,点状结构减少。见图1。

2.3 各组蛋白表达水平比较 与CTRL组比较,HG组DRP1-mito、FIS1、Bax 和Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平升高,DRP1-cyto和Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。与HG 组比较,HG+shRNA-FUNDC1组DRP1-mito、FIS1、Bax 和Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平降低,DRP1-cyto和Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05);HG+shRNA-NC 组细胞各蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),见图2、表2。

2.4 AICAR 激活AMPK 后各组FUNDC1 蛋白表达水平比较 CTRL组、HG 组 和HG+AICAR 组FUNDC1 蛋白表达水平分别为0.34±0.07、1.25±0.15和0.66±0.12,差异有统计学意义(F=46.199,P<0.05)。与CTRL组比较,HG组FUNDC1蛋白表达水平升高,与HG 组比较,HG+AICAR 组FUNDC1 蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图3。

Fig.1 Laser confocal microscope assay of mitochondrial structure(Immunofluorescence staining)图1 激光共聚焦显微镜检测各组线粒体结构(免疫荧光染色)

Fig.2 Western blot assay of mitochondrial fission and apoptosis proteins图2 Western blot检测线粒体分裂和凋亡相关蛋白

Tab.2 Comparison of fission and apoptosis proteins between the four groups表2 各组细胞线粒体分裂和凋亡相关蛋白表达水平比较 (n=3,±s)

Tab.2 Comparison of fission and apoptosis proteins between the four groups表2 各组细胞线粒体分裂和凋亡相关蛋白表达水平比较 (n=3,±s)

*P<0.05;a与CTRL组比较,b与HG组比较,P<0.05。

Fig.3 Western blot assay of AICAR on FUNDC1 protein图3 Western blot检测AICAR对FUNDC1蛋白表达的影响

3 讨论

线粒体融合和分裂的平衡是线粒体生命周期中的重要过程,是不断变化、持续进行的生理进程[9]。在高糖损伤导致的多种疾病中,都伴随着线粒体的过度分裂。Shenouda等[10]发现在糖尿病患者新鲜分离的静脉内皮细胞中,线粒体出现明显的片段化,FIS1 含量显著升高;随后研究了体外培养的主动脉内皮细胞在高糖损伤时线粒体动力学的改变情况,结果显示,调控线粒体分裂的DRP1 和FIS1 在高糖损伤下表达水平均升高,而调控线粒体融合的主要蛋白OPA1 和MFNs 均没有明显的改变;利用siRNA技术敲低FIS1或者DRP1均可以明显降低内皮细胞的氧化应激损伤,降低线粒体的分裂和片段化。Kim等[11]报道,在高糖损伤的视网膜内皮细胞中,线粒体分裂增多,DRP1和FIS1表达水平明显升高,敲低FIS1 或DRP1 均能够提高线粒体功能,减少细胞凋亡。虽然两者在机制上的研究并不相同,但是均观察到了高糖损伤对于线粒体分裂的影响。这与本研究结果一致,说明线粒体的过度分裂广泛地参与了高糖损伤的病理过程。

线粒体的分裂与细胞凋亡之间关系密切。DRP1 是具有鸟苷三磷酸(GTP)酶活性的线粒体蛋白,其介导的线粒体分裂不仅调控细胞凋亡,而且是各类型哺乳动物的细胞凋亡过程所必需的[12]。在细胞凋亡早期,DRP1 从胞浆转移到线粒体外膜,并定位于线粒体的分裂位点,介导Bax的寡聚化,促进细胞色素C 的释放以启动细胞凋亡,在细胞凋亡的过程中引起线粒体的片段化[13]。FIS1在调节线粒体分裂中,主要作为DRP1 募集到线粒体外膜上相互作用的受体,与DRP1 共同促进细胞凋亡。Joshi 等[14]在肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者的成纤维细胞和表达SOD1 突变体的运动神经元中观察到线粒体过度断裂和功能障碍。在这两种细胞模型中,选择性肽抑制剂P110 对DRP1/FIS1 相互作用的抑制导致活性氧水平显著降低,并改善线粒体结构和功能,减少细胞色素C的释放和Bax蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白的表达水平。FIS1还能通过与内质网蛋白相互作用,激活Caspase酶,从而促进线粒体凋亡,并将线粒体和内质网凋亡连接起来[15]。笔者观察到,随着线粒体分裂蛋白FIS1的降低和DRP1向线粒体募集的减少,促凋亡蛋白Bax 表达水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高,体现了线粒体分裂和细胞凋亡之间的一致性。

在心肌细胞,FUNDC1 参与形成线粒体相关的MAM结构,调节内质网Ca2+向线粒体和胞质的释放,通过cAMP应答元件结合蛋白信号通路调节FIS1的表达,在维持线粒体功能、促进心肌重塑中具有重要的作用[16]。细胞损伤时,FUNDC1 可以直接作用于DRP1,也可以通过对线粒体融合和分裂的双向调控,促进线粒体分裂。Chen 等[17]用亚硒酸盐或FCCP引起Hela细胞线粒体应激,研究了FUNDC1对线粒体自噬和线粒体分裂或融合的调控,发现应激状态引起FUNDC1-OPA1 复合体解偶联,同时增强了DRP1 向线粒体的募集,并与DRP1 偶联,形成FUNDC1-DRP1 复合体,引起线粒体片段化和线粒体自噬。线粒体自噬和细胞凋亡之间存在密切的关系。Cai 等[18]发现FUNDC1 能够通过调控缺血再灌注损伤小鼠神经元细胞的线粒体自噬来降低线粒体损伤和细胞凋亡,在这一过程中AMPK 信号通路发挥调控作用。另有研究发现,AMPK 广泛地参与了FUNDC1 依赖的线粒体自噬[19]。本研究结果显示,敲低FUNDC1表达能够降低高糖损伤引起的细胞凋亡,AMPK 信号通路也参与了FUNDC1 对细胞凋亡的调控,这与Cai等[18]的研究结果一致。但是,本研究并没有探讨FUNDC1 对线粒体自噬的作用,而是探究了FUNDC1通过线粒体分裂调控细胞凋亡。虽然在机制上,本文与Cai等[18]的研究并不相同,但是均观察到了线粒体的损伤和片段化以及FUNDC1对细胞凋亡的调控,说明在不同的损伤模型中,同样的蛋白可能通过不同的调节机制对细胞产生同样的保护作用。

综上所述,高糖引起的细胞凋亡与线粒体分裂密切相关,FUNDC1 通过调节线粒体分裂影响高糖损伤的心肌细胞凋亡,这为阐明糖尿病性心脏病的机制提供了理论基础,也为新型的治疗方案提供了新的靶点和理论依据,具有积极的作用。

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