护心通络方通过干预CETP介导脂质代谢抗兔动脉粥样硬化的实验研究

王华，何雄

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病和脑梗死的主要病理基础，其主要病因为高脂血症和脂蛋白代谢紊乱［1-2］。胆固醇脂转运蛋白（CETP）是一种疏水性糖蛋白，在促进脂蛋白间的脂质交换和转运方面发挥主要作用，抑制CETP的转运活性可加速体内胆固醇的转运代谢，降低脂质水平，对动脉粥样硬化的防治具有十分重要的意义［3］。护心通络方是临床经验方，该方秉承活血化瘀的宗旨，基本功效是活血、通络。本课题组前期研究表明，护心通络方对高脂血症患者疗效明显且稳定，尤其对高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）升高作用显著［4］，同时还能降低大鼠内皮细胞凋亡水平［5］。笔者推测护心通络方通过CETP调控HDL-C，进而影响脂质代谢，参与抗AS过程。为验证这一假说，本研究通过建立动脉粥样硬化兔模型，从CETP 介导HDL-C 脂质代谢角度探讨护心通络方抗AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2.5 月龄雄性新西兰兔40 只，体质量（1.8±0.5）kg，购自湖南中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SYXK（湘）2019-0009。动物饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验中心，常规进食饮水，饲养1周后进行实验。

1.2 药物及试剂 护心通络方购自湖南中医药大学第一附属医院制剂中心，主要成分：丹参、田三七、西洋参、天麻、葛根、川芎，中药颗粒经湖南省中医药研究院鉴定。辛伐他汀片购自海南海灵化学制药有限公司，规格10 mg/片，国药准字H20056543。普通饲料（10%脂肪）、高脂饲料（60%脂肪）均购自美国MP Biomedicals公司。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（货号G1120）购自北京索莱宝科技有限公司。CETP 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（货号GV-E19232）购自上海极威生物科技有限公司。腺苷三磷酸结合盒转运子1（ABCA1）、载脂蛋白ApoA-I（apoA-I）和卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（LCAT）引物委托上海生工生物工程有限公司合成。鼠抗兔ABCA1（货号ER1861）、apoA-I（货号P5608）、LCAT（货号FNab04722）和β-actin（货号FNab00873）一抗购自武汉Finetest 生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 动物分组及给药方法 将40只雄性新西兰兔按体质量编号后按照随机数字表法分为空白对照组、AS模型组、辛伐他汀组、护心通络方组，每组10 只。空白对照组予普通饲料喂养22 周；其他3 组高脂饲料喂养14 周后，给予普通饲料喂养8周，辛伐他汀组和护心通络方组分别给予辛伐他汀［0.33 mg/（kg·d）］和护心通络方［0.34 g/（kg·d）］灌胃8周［5］。

1.4 血脂及CETP 检测 分别于实验前、给药14 周、给药22周采血，1 500 r/min离心5 min后分离血清。采用全自动生化分析仪检测血清HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。ELISA 测定血清CETP水平。

1.5 病理组织学观察主动脉斑块形成情况 22周末麻醉并处死动物，分离胸主动脉，4%多聚甲醛固定，常规制成组织石蜡切片，HE染色，显微镜下观察组织病理改变。

1.6 实时荧光定量PCR法（qPCR）检测肝脏ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA 表达 分离处死动物的肝组织，保存于液氮中备用。Trizol 法提取肝脏总RNA，逆转录为cDNA 后行qPCR测定肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT mRNA 的表达量。ABCA1引物：上游5′-ACGTAGCTGTCGCAGGTCACG-3′，下游5′-GCCTTACTGTCAGAGTGACGCT-3′，产物大小164 bp；apoAI 引物：上游5′-GAACCGATCATCGATGACAAC-3′，下游5′-CGACCTAGCATCGATGACGAC-3′，产物大小152 bp；LCAT引物：上游5′-ATCGACGCACGAATGCTCT-3′，下游5′-GTGGATGCAGGGATGATGTTC-3′，产物大小197 bp；内参GAPDH 引物：上游5′-AGAGCACCAHAGGAGGACG-3′，下游5′-TGGGATGGAAACTGTGAAGAG-3′，产物大小103 bp。qPCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40 次。使用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。

1.7 Western blot 检测肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表达水平 取出液氮中冻存的肝组织，切成1 mm3的小块。预冷的PBS充分清洗组织后，使用组织蛋白提取剂获取组织蛋白，BCA 法测定样品蛋白浓度。并依次予以SDS-PAGE、转膜，将转好的膜加入5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。除去封闭液，加入ABCA1、apoA-I、LCAT、β-actin一抗（均为1∶1 000稀释），4 ℃过夜。次日回收一抗，用TBST洗3次，每次5 min，加入二抗（1∶2 000 稀释），室温孵育30 min，TBST 洗涤4 次，每次5 min。滴加新鲜配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面侧，于暗室曝光，在不同的光强度调整曝光条件下显影、定影，计算目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法 釆用GraphPad 7.0 进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内多重比较采用Turkey 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物死亡情况 实验过程中，空白对照组无动物死亡，AS模型组因腹泻死亡2只，辛伐他汀组和护心通络方组因感染和腹泻各死亡1只，均予剔除。

2.2 各组兔血脂水平变化 实验前各组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验14 周时，与空白对照组比较，AS 模型组、辛伐他汀组、护心通络方组血清TC、TG、LDL-C升高，HDL-C下降（P＜0.05），提示AS模型均已构建成功。实验22 周时，与AS 模型组相比，辛伐他汀组、护心通络方组血清TC、TG、LDL-C 下降，HDL-C升高（P＜0.05），见图1。

2.3 各组兔血清CETP 水平比较 空白对照组、AS模型组、辛伐他汀组和护心通络方组血清CETP水平（μg/L）分别为29.82±3.17、55.41±6.89、40.38±3.21、37.51±4.63，组间比较差异有统计学意义（F=63.197，P＜0.01），与空白对照组相比，AS 模型组血清CETP水平升高；与AS 模型组相比，辛伐他汀组和护心通络方组血清CETP水平下降。

2.4 各组兔主动脉壁形态变化 空白对照组大鼠主动脉内膜完整，未见泡沫细胞和炎性细胞浸润，无脂质沉积。AS模型组可见主动脉内膜明显增厚，部分内皮细胞脱落，内膜下可见泡沫细胞和脂质沉积。辛伐他汀组和护心通络方组的病理学改变较AS 模型组减轻，见图2。

2.5 各组兔肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT mRNA 的表达水平比较 与空白对照组相比，AS模型组肝脏ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。与AS 模型组相比，辛伐他汀组和护心通络方组肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT mRNA 表达升高（P＜0.05），见表1。

Fig.1 Changes of serum lipid levels in each group图1 各组兔血脂水平变化

2.6 各组兔肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表达水平比较 与空白对照组相比，AS 模型组肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与AS 模型组相比，辛伐他汀组和护心通络方组肝脏ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表达水平升高（P＜0.05），辛伐他汀组和护心通络方组ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图3。

Fig.2 Morphological changes of aortic wall in each group(HE staining,×400)图2 各组兔主动脉壁形态变化（HE染色，×400）

Tab.1 Comparison of mRNA expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表1 各组兔肝脏ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA表达水平比较 （±s）

Tab.1 Comparison of mRNA expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表1 各组兔肝脏ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA表达水平比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与AS模型组比较，P＜0.05。

Tab.2 Comparison of protein expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表2 各组兔肝脏ABCA1、apoA-I和LCAT蛋白表达水平比较 （±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表2 各组兔肝脏ABCA1、apoA-I和LCAT蛋白表达水平比较 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与AS 模型组比较，P＜0.05。

Fig.3 The protein expressions of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver of rabbits in each group detected by Western blot assay图3 Western blot检测各组兔肝脏ABCA1、apoA-I和LCAT蛋白表达

3 讨论

高脂血症是冠状动脉粥样硬化的主要原因，而他汀类作为临床应用最广泛的调脂类药物，已被证实可以降低心肌梗死、脑卒中等不良心脑血管事件的发生率，但长期应用容易出现肝肾功能异常、肌肉疼痛等不良反应［6］。中医药立足整体，辨证施治，具有不良反应少，疗效稳定的优势。传统医学认为高脂血症以“瘀”为主要病机，其内因为脾弱气虚、肝肾亏虚，外因为饮食不节、过逸少劳；内外因相互作用导致痰湿内生，蕴而化瘀。护心通络方中的三七有散瘀、止血、消肿止痛之功效；天麻甘平，入肝经，息风，定惊，治眩晕眼黑；葛根性味辛甘，性凉发散；辛者，既可解表，又可通里，在外能舒筋活络，在内又能通行血气；诸药合用，活血不伤血，生新不留瘀。

研究发现，HDL-C 能够通过胆固醇逆转运（RCT）、抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡及舒张血管来发挥保护血管、抗动脉粥样硬化的功效，HDL-C 水平降低是脂质代谢紊乱的主要原因［7-9］。CETP是一种肝脏合成的糖蛋白，在循环中大部分与HDL-C 结合，在促进脂质交换和转运中起关键作用，与动脉粥样硬化的发展联系紧密［10-11］。RCT包括清除外周细胞中游离胆固醇及将游离胆固醇转运至肝脏代谢2个过程，其中ABCA1/apoA-I/LCAT 通路在RCT 过程中起至关重要的作用［12-13］。ABCA1可利用腺苷三磷酸水解释放的能量将胆固醇和磷脂从外周细胞流出，与细胞外的apoA-l 结合形成盘状的磷脂复合物［14］。apoA-Ⅰ是ABCA1介导的通过巨噬细胞的胆固醇外流的最优受体。细胞内的胆固醇通过扩散跨膜流出后被盘状的磷脂复合物捕获，形成前β-HDL，CETP 能促使前β-HDL 形成，在LCAT 催化下卵磷脂分子中的脂肪酸转移到游离胆固醇形成胆固醇酯，并移向HDL 的中心，使HDL 颗粒转变成富含胆固醇的成熟HDL-C。HDL-C 一部分通过清道夫受体B1进入肝脏，从循环中清除；另一部分经CETP运送至含apoB 脂蛋白，CETP 将HDL-C 上的胆固醇脂转移到极低密度脂蛋白（VLDL）和LDL，LDL通过结合LDL 受体被肝脏清除。因此CETP 可降低循环中的HDL-C，同时提高LDL-C，高水平的CETP已成为冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要危险因素［15-16］。通过降低CETP 水平有助于提高ApoA1 和HDL-C的水平，降低动脉粥样硬化性心脏病的发生风险［17］。

本研究发现，经过8周的药物干预后，相比造模成功的AS 模型组，护心通络方组大鼠血清CETP 水平明显下降，HDL-C 升高，TC、TG、LDL-C 水平明显下降，同时肝脏ABCA1/apoA-I/LCAT 通路的蛋白表达明显升高。本课题组前期已证实护心通络方能明显升高大鼠HDL-C，降低TC、TG、LDL-C和全血高、中、低切黏度，抑制内皮细胞凋亡［4-5］。结合上述结果，笔者认为护心通络方可能通过抑制CETP 的表达，进而激活ABCA1/apoA-I/LCAT 通路，提高HDLC的水平，最终减轻兔高脂血症和动脉粥样硬化。