三种氟苯尼考制剂溶出度测定和药代动力学比较

Ke a npen，刘继根，赵易艺，温华鑫

（1.美国道勤生物科学，加州 弗里蒙特 94555；2.长沙道勤生物科技有限公司，湖南 长沙 410126）

氟苯尼考是在氯霉素与甲砜霉素的基础上通过官能团的改变得到的，属于氯霉素类动物专用的广谱抗生素药物[1-2]。其作用机制是在动物体内可与细菌内50S可逆性的亚基结合，阻止细菌酶的乙酰化作用，阻断肽链延伸来抑制蛋白质的合成，起到抑制细菌的作用[3-6]。它的抗菌活性优于氯霉素和甲砜霉素，副作用极小，不会引起肾衰竭等严重问题且没有再生障碍性贫血等不良反应。主要用于牛、猪、鸡和鱼类的细菌性疾病[7]。但由于氟苯尼考溶解度极差，分散性差，且溶出慢，在吸收部位解离度小，进而导致氟苯尼考在生物体内的生物利用度低，其在临床上的应用也受到了严重的限制[8-10]。为了解决提高氟苯尼考的水溶性的同时增加其药物制剂的生物利用度的技术问题，美国道勤生物科学公司研发了星月制剂氟苯尼考,遮蔽了氟苯尼考的苦味并提高其水溶性，提高了药物的生物利用度。本试验通过星月尼考与普通水溶性氟苯尼考和普通不可溶性氟苯尼考两种不同工艺制剂，在人工胃液和人工肠液中进行体外溶出度对比，以及对三种不同工艺药物在猪体内的药代动力学特性进行分析，从而对星月制剂的工艺进行评价，以期为药物合理使用以及企业的生产提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

乙酸乙酯（分析级）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱级），购自天津市光复科技发展有限公司。氟苯尼考标准品（CAS：K0302010，规格100 mg，含量99.6%），购自中国兽医药品监察所。20%氟苯尼考粉（星月制剂产品），由湖南道勤生物科技有限公司提供；20%氟苯尼考粉1（普通不水溶产品）、20%氟苯尼考粉2（普通水溶产品）均为市面上在售产品。

1.2 仪器

高效液相色谱仪：SHIMADZU LC-16，岛津仪器（日本）有限公司；高速冷冻离心机：TGL-16，长沙湘仪仪器有限公司；水浴氮吹仪：μgC-24M，北京优晟联合科技有限公司；电子天平：SHIMADZU AUW120D，岛津仪器（日本）有限公司；涡旋混合器：XW-30S，上海仪昕科学仪器有限公司；可调微量移液枪：Eppendorf5424。智能溶出仪：ZRS-8DS，博科科技有限公司；紫外分光光度计：756S，上海棱光技术有限公司。

1.3 溶液配制

氟苯尼考标准储备液(1mg/mL):精确称取20mg氟苯尼考标准品置于20 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-20℃保存备用。使用时配成不同浓度的氟苯尼考标准工作液，标准储备液按乙腈∶水（3∶7)的溶液稀释而成，现配现用。

人工胃液：量取盐酸16.4 mL到1L容量瓶中，加入800 mL水和胃蛋白酶10 g，溶解后摇匀，加水定容即得。

人工肠液：称取磷酸二氢钾6.8 g，加入500mL水使其溶解，用0.1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值为6.8，另取胰酶10g加水溶解，两液混合后加水定容至1L即可。

1.4 试验动物

选择健康、体重相近的三元杂商品猪12头(平均体重40.0±1.5 kg)，给药前三天饲喂不含任何药物的基础日粮，自由饮水。在给予氟苯尼考粉之前10～12小时禁止给猪喂食，拌料给药6h后自由采食和饮水。

2 分析方法

2.1 不同介质体外溶出度比较

2.1.1 氟苯尼考标准曲线绘制

分别精密吸取标准品溶液（1mg/mL）0.5mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5mL、3 mL、3.5 mL于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容，制成氟苯尼考浓度分别为50、100、150、200、250、300、350μg/mL的溶液。配置的人工胃液、人工肠液分别为空白对照，266nm波长处测吸光度，根据吸光度（A）为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标进行线性回归。得到标准曲线的线性回归方程A=0.0027C+0.0064,R2=0.9986，氟苯尼考浓度为50～350μg/mL时，吸光度(A)与浓度(C)呈线性关系。

2.1.2 体外溶出度的测定

按2020年版《中国药典》[11]关于溶出度与释放度测定方法中的桨法进行测定，精密称取3中不同工艺氟苯尼考粉约1g，置入溶出杯中，分别以已超声脱气的人工胃液、人工肠液900 mL为介质，转速100 r/min，温度(37.0±0.5)℃，从样品进入介质开始计时，分别于5、10、15、20、30、60、90 min定点取样5mL，取样后立即向溶出杯中补充相同温度和体积的介质，取出的样品溶液在30 s内用0.45μm的微孔滤膜过滤。取续滤液（续滤液需要稀释至浓度在标曲范围内）在266nm波长处测定吸收度A。将吸光值(A)代入标准曲线回归方程，可计算得到各时间点的氟苯尼考累积溶出百分率(%)。计算累积溶出=An+(An+An-1+……+A2+A1)×V1/V2，式中An为某个时间点的溶出率，V1为各时间点固定取样体积，V2为溶出介质体积[12]。

2.2 药代动力学比较

2.2.1 给药方法及采血时间

试验猪随机分成3组，公母各半,每组4个重复，分别为星月制剂氟苯尼考A组、普通不水溶氟苯尼考粉B组、普通水溶性氟苯尼考粉C组。各试验组在基础饲料基础上分别添加每头猪单剂量为20 mg·kg-1（以氟苯尼考计）的不同制剂的氟苯尼考粉。给药前（0h）耳下静脉采血约5mL作为空白对照。拌料给药后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、36h各采血1次，每次采血约5mL。将其置于含肝素的离心管中，4000 r/min离心10 min，分离上清血浆，分装并标记后置于-20℃冻存待测。

2.2.2 样品处理

取血浆样品0.5mL置于10mL离心管中，加1.5mL乙酸乙酯，涡旋混合5min，4000r/min离心10min，取上层乙酸乙酯上清液，重复提取一次，合并两次乙酸乙酯提取液，氮气吹干，残留物用0.25mL的流动相溶解，涡旋混合5min，12000r/min离心5min，过0.45μm滤膜，上样进行测定。

2.3.3 仪器条件

液相色谱条件：流动相：水∶乙腈（68∶32，V/V）；色谱柱：SHIMADZUETA-16C C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃；进样体积：20μL；检测波长：224nm；流速：1.0mL/min。

标准工作曲线：用流动相将储备液稀释成0.025、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10μg/mL的标准工作溶液，按照样品处理方法处理，取20μL进行HPLC测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算出线性回归方程和相关系数。

2.3.4 数据处理和统计分析

选用WinNonlin5.2.1药物代谢动力学软件，非房室模型处理不同氟苯尼考在猪体内的“血药浓度—时间”数据，利用SPSS统计软件进行药动学参数方差分析比较。

3 结果与分析

3.1 不同介质体外溶出度

三种不同工艺氟苯尼考粉在不同介质中的体外溶出曲线如图1、图2所示。由图1可知，在人工胃液中，三种氟苯尼考制剂以普通水溶性的氟苯尼考粉的终溶解度最高，30 min时星月尼考溶出度为56.05%，小于普通水溶性氟苯尼考（72.19%）、大于普通不水溶性氟苯尼考（33.64%）；通过图2可知，与水溶性和不水溶性氟苯尼考相比，星月制剂工艺氟苯尼考在人工肠液中的溶出度和溶出速度大大提高，在5min时普通水溶性和不水溶性氟苯尼考的累计溶出度分别为93.5%和3.3%，而星月尼考的溶出度高达52.34%。溶出时间30 min时，星月尼考的溶出度达到了94.88%，水溶性氟苯尼考和不水溶性氟苯尼考溶出度分别为85.61%和38.83%。根据Noyes-Whitney溶出理论及生物利用度相关公式，可预测星月尼考的生物利用度增大，为后续生物利用度研究提供了理论基础。

图1 三种氟苯尼考粉在人工胃液中的体外溶出曲线

图2 三种氟苯尼考粉在人工肠液中的体外溶出曲线

3.2 血浆中药物浓度

猪服用星月制剂氟苯尼考粉、普通不水溶氟苯尼考预混剂1和普通水溶氟苯尼考预混剂2后各采血点血药浓度见表1；服用星月制剂氟苯尼考粉、普通不水溶氟苯尼考预混剂1和普通水溶氟苯尼考预混剂2后各血药浓度-时间曲线见图3。

图3 3种不同工艺氟苯尼考制剂在猪体内的药-时曲线

表1 口服氟苯尼考预混剂后的氟苯尼考在猪体内的平均血药浓度

3.3 主要药代动力学参数

由表2可知，星月尼考、普通不水溶氟苯尼考、普通水溶氟苯尼考的药峰浓度分别为8.05μg/L、7.36μg/L和7.58μg/L，达峰时间分别为：4.0h、1.68h和1.57h，计算得到的药时曲线下面积（AUC）分别为59.87h·μg/mL、37.31h·μg/mL和42.29h·μg/mL。比较可看出，拌料饲喂不同工艺的氟苯尼考粉后，星月尼考达到血药峰浓度的时间较晚，但其药峰浓度分别是不水溶氟苯尼考、水溶的氟苯尼考的1.09和1.06倍，药时曲线下面积分别是不水溶氟苯尼考、水溶的氟苯尼考的1.60和1.42倍。表明星月制剂工艺使氟苯尼考具有缓释作用，吸收稍慢但相对充分，拌料饲喂星月尼考药峰浓度更高，药时曲线下面积更大，消除更缓慢，发挥作用的时效更长。

表2 3种不同工艺氟苯尼考粉在猪体内的主要药动学参数

4 结论

本试验模拟药物在体内胃肠道中的不同运转状态，比较了不同pH值条件下不同工艺氟苯尼考粉的溶出行为，对3种不同工艺氟苯尼考制剂的溶出度情况进行评估。测定其在人工胃液、人工肠液中的溶出情况，通过分析发现，星月尼考在肠道内的溶出度较胃液中高，说明在肠道内星月尼考更有利于吸收。星月工艺制剂使药物在肠道环境中呈现亲肠黏膜易吸收状态，在胃液环境中呈现疏胃液和胃黏膜的聚合状态，因而全面导入星月制剂工艺的星月尼考与普通氟苯尼考相比较，毒副作用更小，吸收利用率更高。该工艺不仅有效增大了溶解度，提高了药物生物利用度，在临床使用中具有很强的优势，对降低成本，提高药效具有长远的意义。