乌骨鸡禽白血病病毒感染病例的诊断

王心媛，张泽颖，杨磊，宁玲忠，蒙丽舟，马宏超，苏建明，雷红宇

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

禽白血病（Avian leukosis）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）等引起的禽类多种肿瘤性传染病的总称，临床上包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病和骨髓细胞瘤病等多种，以淋巴细胞性白血病最常见[1]。禽白血病病毒（ALV）是一种反转录病毒，根据其囊膜蛋白特性可分为多种亚型，其中J亚型是常见的亚型[2]。动物感染ALV后的病理变化主要是在法氏囊、肝、脾或骨髓等多器官组织出现肿瘤，从而导致生长迟缓、生产性能下降，以及抵抗力下降而容易感染其他病菌致使死亡率增加，严重危害养禽业的健康发展，是我国动物疫病规划防控的主要禽病之一。乌骨鸡是我国特有的药用珍禽，在各地形成不同类型的地方品种，具有很大的发展前景[3]。这些年来，关于地方品系鸡群中发生禽白血病的报道逐年增多，给乌骨鸡养殖的发展带来巨大威胁[4]。本文拟对一例湖南本地乌骨鸡疑似ALV感染的病例进行研究，通过临床观察、实验室检测等进行诊断，为临床上发生禽白血病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源

疑似ALV感染病例来自于湖南省某规模化乌骨鸡种鸡场。

1.1.2 实验药剂

ALV p27抗原检测试剂盒，购自美国IDEXX公司；Trizol试剂、反转录试剂盒，购自北京全式金生物科技有限公司；苏木素、伊红试剂，购自南昌雨露实验器材有限公司；无水乙醇、二甲苯、石蜡、福尔马林、甘油、氯仿、异丙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料采集

先从发病鸡场详细了解临床医学资料，根据其临床症状和剖检眼观病理变化初步诊断，采取疑似病例的内脏器官，部分置于10%福尔马林溶液中，部分置于-80℃冰箱保存备用。同时，采集部分病鸡的精液、鸡蛋清和血液，置冰箱保存备用。

1.2.2 ALVp27抗原检测

采用ELISA方法进行病料中ALV群特异性抗原p27的检测，参照IDEXX禽白血病p27抗原检测试剂盒说明书进行，具体如下：先将被检样品稀释500倍，取100μL阴性对照、阳性对照、稀释的被检样品分别加入检测板的不同孔中，37℃下孵育1h，洗涤3～5次。每孔再加入100μL酶标抗体，37℃下孵育1h，洗涤3～5次。每孔加100μL的TMB底物溶液，室温避光显色15 min。最后每孔加100μL的终止液，在650 nm波长下测量其吸光度值（A650)。根据公式计算数据，公式为：S/P值=（待检样品OD值－阴性对照OD值）/(阳性对照OD值－阴性对照OD值）。结果判断标准为：S/P＜0.2为阴性，S/P≥0.2为阳性。

1.2.3 病理变化观察

对发病明显的病鸡进行剖检，观察并记录各脏器眼观病理变化。采集病鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏等组织器官于10%福尔马林溶液中固定，进行常规石蜡切片及苏木素伊红染色，中性树脂封片后，在光学显微镜下观察其组织学病理变化。

1.2.4 RT-PCR检测

参照胡海等[5]方法设计并合成ALV特异性P27检测引物，上游引物序列为：5′-CCGGGGGAACTG GTTGCTAT-3′,下游引物序列为：5′-ATCTGGC TGTGACTTCTGCC-3′。采用RT-PCR对病料样品进行ALV检测，Trizol法提取组织总RNA，根据cDNASynthesis Kit说明书将提取的RNA逆转录成cDNA，各反应体系如下：利用反转录试剂盒反转录生成cDNA，并以此为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：2×Taq Mix 12.5μL，ddH2O 8μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 2.5μL，共25μL。扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃再延伸10min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，于紫外光凝胶成像分析系统下观察。

2 结果与分析

2.1 临床症状与眼观病变

根据临床资料调查得出，病鸡最早出现在5周龄时，到20周龄时死亡率最高。临床上可见病鸡出现精神萎顿、食欲减少、消瘦，触摸可见胸骨轻微变形（图1 A）。部分病例出现腹泻、腹部肿大。剖检可见肝脏颜色深红，体积较正常肝脏大几倍，其表面和切面上散在分布有结节型或弥漫型灰白色病灶，部分病例在肠系膜上也可见结节（图1 B～D）。

图1 病鸡的临床症状和眼观病变

2.2 组织学病理变化

光学显微镜下病鸡肝脏病变最为明显，可见病鸡肝组织的正常结构被破坏，肝索排列发生紊乱，肝细胞出现变性、坏死，可见核浓缩、核碎裂和核溶解。肝脏中央静脉和小静脉扩张，充满大量血液，血管周边有大量成淋巴细胞浸润增生，呈灶状或弥漫性分布（图2）。

图2 病鸡肝脏的组织学病变

2.3 ALV p27抗原检测结果

对病鸡样品进行ELISA检测，结果显示ALV p27抗原阳性率为100%。

2.4 RT-PCR检测结果

取病鸡的肝脏组织，提取其RNA、经反转录及PCR等检测后，琼脂糖凝胶电泳结果显示病料样品均扩增出225bp的目的片段（图3），结果表明：病鸡已感染ALV。

图3 病鸡肝脏PCR检测结果

3 讨论

乌骨鸡是我国特有的一个家禽遗传资源，属肉蛋药兼用型鸡种，具有较高的营养价值和药用价值，在多个地方有其优势品种和配套系[3]。禽白血病是一种禽类肿瘤性传染病，该病的传播方式主要是水平传播和垂直传播，临床上以免疫抑制、生长迟缓、产蛋率下降以及多器官组织发生肿瘤为主要特征，给养殖业造成巨大经济损失。本研究对湖南某乌骨鸡种鸡场采集的病料（疑似禽白血病），通过ELISA方法检测出ALVp27抗原，通过RT-PCR检测确定了ALV的感染，同时结合临床症状和病理变化，确诊该鸡场出现由ALV所致的淋巴细胞性白血病。

对于禽白血病的检测方法，目前已经建立的有IFA、ELISA、ISH、PCR、荧光定量RT-PCR等方法。奚德华等[6]对IFA、ELISA和RT-PCR方法进行比较，发现这三种方法的阳性和阴性符合率均较高，但各自有优缺点，其中ELISA适合在临床上使用，RT-PCR和IFA敏感性更高，适合在实验室进行诊断。因此，在禽白血病的诊断上应该尽量结合多种方法进行。由于ALV感染后病鸡出现免疫抑制，在临床上常因并发其他疾病而引起鸡群大量死亡[7]，因此，在诊断时应仔细区分。

虽然禽白血病在全世界流行性非常广泛，但大多数养鸡业发达的国家都已经基本消灭和控制。我国也采取多种措施加强对禽白血病防控，目前，对白羽肉鸡和蛋鸡群中该病防控与净化已有明显进展，且依然需要进行定期监测。但是，由于我国地方鸡群品种繁多，养殖环境复杂，禽白血病的防控效果成效不佳，严重危害了我国地方品种鸡的健康发展[8]。因此，还需进一步了解ALV的流行特征和变异机制，研发快速检测技术，切实加强各地养鸡场（尤其是种鸡场）的禽白血病监控和净化工作，保障养禽业的健康发展。