髓细胞条件性METTL3基因敲除小鼠的构建与鉴定

陶佳嫦，秦国慧，李 玲，张 毅

郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心和肿瘤中心 郑州 450052

正常生理条件下，骨髓中的造血干细胞向祖细胞分化，之后分化为未成熟的髓细胞，迁移至外周器官后分化为树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等。但肿瘤、自身免疫性疾病的发生导致细胞因子异常累积，阻断未成熟髓细胞分化，导致具有免疫抑制功能的髓细胞累积，这群细胞被称为髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)。MDSC可通过抑制免疫效应细胞的功能促进肿瘤进展[1]。除此之外，在肿瘤微环境中，MDSC可以促进调节性T细胞(T regulatory cell，Treg) 的累积[2]、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM) 的形成[3]、成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF) 分化，进而导致肿瘤患者的不良预后[4]。MDSC、Treg、TAM和CAF为肿瘤微环境中具有免疫抑制作用的主要细胞，这些细胞在病理状态下的激活会导致免疫抑制物质的产生[5]，这些物质可抑制CD8+T细胞或NK细胞的增殖和功能，促进肿瘤进展。目前研究[6-7]表明，体内循环中MDSC水平与肿瘤患者生存有关并增加肿瘤患者对免疫检查抑制剂耐药的风险。因此，明确MDSC免疫抑制功能的机制将为靶向MDSC、提高肿瘤免疫治疗效果提供基础。

RNA甲基化是转录组学中一种重要的修饰，通过甲基转移酶来催化和维持。METTL3为甲基化过程中主要的甲基转移酶。研究[8-10]表明，METTL3在脑胶质瘤、肝癌及乳腺癌等多种肿瘤中发挥促进肿瘤进展的作用。METTL3全基因敲除小鼠具有胚胎致死性，鉴于MDSC由骨髓细胞分化而来，因此作者拟构建髓细胞条件性METTL3基因敲除小鼠，为研究METTL3在MDSC中的作用提供动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：METTL3(flox/flox)雄性小鼠从中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所童明汉教授处获得，Lyz2-cre雌性小鼠购于集萃药康生物科技股份有限公司，均为C57BL/6遗传背景，野生型C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于12 h光照/12 h黑暗条件下，自由进食和饮水，所有操作均符合实验动物伦理学要求(GDY1801016)。动物饲养均在河南省肝病药理重点实验室完成。主要试剂：通用基因组DNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PrimeSTAR(日本TaKaRa公司),DNA Marker、琼脂糖粉(美国Invitrogen公司)，SYBR Green Mix(荷兰Bioconnect公司),重组METTL3抗体、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor®488，英国Abcam公司)，PE/Cyanine7抗鼠/人CD11b抗体(美国 Biolegend公司)。

1.2 髓细胞条件性METTL3基因敲除小鼠的构建策略METTL3(flox/flox)小鼠是在METTL3基因4号外显子两端各插入一个LoxP位点(图1)的小鼠。基于cre/LoxP位点特异性重组酶系统原理，METTL3(flox/flox)小鼠与髓细胞特异表达Cre酶的Lyz2-cre小鼠交配后，Cre重组酶特异性识别LoxP位点，通过同源重组实现髓细胞中靶基因的特异性敲除。

图1 METTL3基因LoxP位点的插入情况

1.3 构建过程METTL3(flox/flox)雄性小鼠与Lyz2-cre(+/+)雌性小鼠杂交得到METTL3(flox/-)Lyz2-cre(+/-)小鼠，METTL3(flox/-)Lyz2-cre(+/-)小鼠自交最终得到METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠。

1.4 小鼠基因型鉴定通过PCR反应及琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型。DNA提取：剪取交配后第2代子鼠(3～4周龄)尾尖2～5 mm，置于 1.5 mL Eppendorf 管中，采用通用基因组DNA提取试剂盒提取DNA。使用Sangon Biotech公司合成的引物进行PCR，引物序列见表1。DNA扩增体系(25 μL)：PrimeSTAR 12.5 μL,模板DNA 1 μL,DEPC水 9.5 μL，10×上、下游引物各1 μL。LoxP位点PCR反应程序为94 ℃5 min；94 ℃15 s，65 ℃30 s，72 ℃50 s，10个循环(每个循环降低1 ℃)；94 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃50 s，30个循环；72 ℃7 min，4 ℃保存。Cre位点PCR反应程序为95 ℃5 min；98 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃45 s，20个循环(每个循环降低0.5 ℃)；98 ℃30 s；55 ℃30 s；72 ℃45 s；72 ℃5 min；10 ℃保存。PCR产物鉴定:用琼脂糖和1×TAE电泳缓冲液配制混合液，将凝胶移至装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，在样品槽中加入DNA样品，145 V恒压电泳，最后采用凝胶成像分析系统观察分析。基因型电泳条带大小：METTL3(flox/flox)为一199 bp的条带，METTL3(flox/-)为两条带，分别为199、159 bp，METTL3(-/-)为一159 bp的条带；Lyz2-cre(+/+)为一1 413 bp条带，Lyz2-cre(+/-)为1 413、357 bp两条带，Lyz2-cre(-/-)为一357 bp条带。

表1 用于基因鉴定的PCR引物序列

1.5 METTL3基因敲除效果验证1.3中自交得到16只小鼠，经1.4基因型鉴定确认6、11号小鼠为含有cre位点的flox纯合子小鼠，以下鉴定采用编号“6”的纯合子小鼠。

基因水平敲除效果的鉴定：待小鼠4周龄后，取野生型小鼠及6号小鼠骨髓细胞。提取DNA，使用特异性引物进行PCR，METTL3上游引物序列5’-GATGCTGTTTCCATCCGTCT-3’，下游引物序列5’-GAGGCAGGCATCCTAAGTGA-3’，产物送上海生工生物工程有限公司测序。

骨髓细胞中METTL3 mRNA表达的检测：取野生型小鼠及6号小鼠骨髓细胞，加入Trizol提取RNA，反转录获取cDNA;METTL3上游引物序列5’-GGGCCCAGGTGCAAGAATTTTG-3’,下游引物序列5’-CACCCCCAACACTCTGTGTAAGA-3’，以 2 μL cDNA 为模板，加入10 μL SYBR Green Mix染料，上、下游引物各4 μL进行qPCR，结果以 2-ΔΔCt表示。采用GraphPad Prism 8对结果进行分析。

骨髓细胞中METTL3蛋白表达的检测：取野生型小鼠及6号小鼠骨髓细胞，PBS重悬，加入1 μL CD11b流式抗体(髓系细胞的表面标志物)，4 ℃孵育15 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入400 μL多聚甲醛,4 ℃固定20 min，离心弃上清。加入1×破膜剂，4 ℃静置20 min，离心弃上清。加入用破膜剂以1∶400的比例稀释的METTL3一抗，4 ℃孵育15 min，离心弃上清。加入用PBS以1∶2 000的比例稀释的荧光二抗，孵育20 min。PBS重悬细胞，离心弃上清。加入200 μL PBS，用成像流式细胞仪检测METTL3、CD11b的表达。

2 结果

2.1 METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠鉴定METTL3(flox/-)Lyz2-cre(+/-)自交，得到16只小鼠，分别进行METTL3和Lyz2-cre基因型鉴定。

2.1.1METTL3(flox/flox)基因型鉴定 METTL3(flox/-)自交得到3种子代，分别为METTL3(flox/flox)、METTL3(flox/-)、METTL3(-/-)。基因型鉴定结果见图2,仅可以扩增出159 bp条带的为野生型(第2、5、12、15号)，可以同时扩增出159、199 bp条带的为杂合子(第3、4、7、9、10、13、14号)，仅可以扩增出199 bp条带的为METTL3(flox/flox),即需要的纯合子(第1、6、8、11、16号)。

图2 小鼠1～16 METTL3(flox/flox)基因型鉴定结果

2.1.2Lyz2-cre基因型鉴定 Lyz2-cre(+/-)自交得到3种子代，分别为Lyz2-cre(+/+)、Lyz2-cre(+/-)和Lyz2-cre(-/-)。基因型鉴定结果见图3。其中基因型为Lyz2-cre(+/+)的子代可以扩增出1 413 bp的条带(如5、6、9、11、12、15)，基因型为Lyz2-cre(+/-)的子代可以扩增出1 413 bp和357 bp的条带(如1、3、4、7、10、13、14、16)，而基因型Lyz2-cre(-/-)的子代可以扩增出357 bp的条带(如2、8)。

图3 小鼠1～16 Lyz2-cre基因型鉴定结果

2.1.3METTL3(flox/flox)Lyz2cre(+/+)小鼠个体的获得 综合分析METTL3(flox/flox)基因型和Lyz2-cre基因型鉴定结果，确认6、11号子代鼠基因型为METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)，是敲除了METTL3的目的鼠。

2.2 METTL3基因敲除效果的验证见图4。基因水平敲除效果的鉴定:PCR产物测序结果显示6号小鼠编码区外显子4被敲除。

A：野生型小鼠与6号小鼠骨髓细胞基因组DNA的测序结果；B：野生型小鼠与6号小鼠METTL3 DNA改变的示意图

骨髓细胞中METTL3 mRNA表达水平：qPCR结果显示6号小鼠骨髓细胞中METTL3 mRNA的水平低于野生型小鼠[(0.301±0.060)vs(0.997±0.003)，t=4.712，P=0.009]，提示METTL3基因敲除成功。

骨髓细胞中METTL3蛋白表达水平：与野生型小鼠相比，6号小鼠骨髓细胞中METTL3蛋白的表达水平降低(图5)。

A、B、C：野生型小鼠；D、E、F：6号小鼠

3 讨论

RNA是基因表达的中心组成部分，起着连接遗传信息(DNA)和蛋白的作用。调控基因表达涉及多种机制。RNA在转录期间或转录后的化学修饰可参与基因表达的调控。在所有的RNA物种中发现了超过100种的转录后修饰[11]。在这些修饰中，真核mRNA中的N6甲基腺苷(m6A)修饰是最广泛的化学性修饰[12]。越来越多的证据[13-17]表明m6A参与多种类型的人类癌症的发生发展，包括肺癌、结肠癌、乳腺癌和急性髓系白血病。m6A的水平受到甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白的严格调控。甲基转移酶主要包括METTL3、METTL14、METTL16等蛋白。METTL3作为主要的甲基转移酶，已被证实在脑胶质瘤、肝癌及乳腺癌等多种肿瘤[8-10]中发挥促癌作用，但在免疫细胞中报道有限。目前的研究[18-20]证明METTL3 可促进树突状细胞的激活，并参与维持T细胞稳态与分化的调节。MDSC是肿瘤微环境中的重要细胞成分，可抑制T细胞的功能，促进肿瘤的进展。因此，靶向MDSC的免疫治疗也可作为未来肿瘤免疫治疗的新方向。而探究METTL3在MDSC中的作用和机制则可为靶向MDSC的免疫治疗提供新的思路。

基因敲除小鼠是在小鼠全部组织或特定组织中使某基因功能缺少，是阐明该基因功能最直接有效的方式之一。全基因敲除小鼠也被用于研究某基因的作用[21]。

Cre/LoxP重组酶系统是目前用于条件性基因敲除最常用的系统工具之一。LoxP序列中的特殊回文结构可以被Cre酶特异性识别结合并催化 2 个 LoxP 序列之间的片段发生同源重组，进而实现对该片段的基因敲除。

本研究为构建髓源细胞METTL3基因条件性敲除小鼠。该小鼠的构建为在METTL3的4号外显子左右各插入一个LoxP位点，通过与髓系细胞中特异表达Cre酶的Lyz2-cre小鼠杂交，最终获得METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠。由于MDSC是由髓细胞分化而来，而METTL3在髓细胞中被敲除，因此骨髓细胞在体外被诱导成MDSC后，可使METTL3在MDSC中不能正常表达。而由于Lyz2是在髓细胞中特异表达的酶，因此METTL3(flox/flox)Lyz2-cre(+/+)小鼠也为研究METTL3在其他髓源细胞如巨噬细胞或中性粒细胞中的作用提供了动物模型。