葛根素对糖尿病认知功能障碍大鼠Akt-CREB信号通路的影响研究

靳 萱，雪颜锋

糖尿病认知功能障碍 (DCI)也被称为糖尿病脑病，是由糖尿病慢性长期糖代谢紊乱损伤脑血管、中枢神经系统等引起的，以记忆力减退、学习能力降低、语言能力受损等轻、中度认知障碍为主要表现的严重并发症[1]。据统计，目前全世界糖尿病患者数量已达到4.15亿[2]，我国成人糖尿病发病率居于首位，达11.6%左右，其中25%～36%的患者可发生不同程度的认知功能障碍，并且随着糖尿病发病率不断攀升而增加。DCI病情呈进行性进展，治疗不及时可发展为痴呆，会对患者及其家庭造成沉重负担。早期采取手段进行干预来延缓病情发展是DCI治疗的主要目的，目前临床上主要采用胰岛素、改善脑血管循环药物、血管紧张素转换酶抑制剂等进行针对病因的治疗[3]，但仍尚缺乏规范、明确的治疗措施。近年来，中药在DCI防治中的作用备受关注，李莹等[4]对十年左右的相关研究进行综述、分析，认为无论是经典方剂、中成药，还是单味药、中药有效成分均具有独特的优势和疗效，值得深入研究。葛根素是中药葛根中提取的异黄酮成分，已有研究称[5]，其在糖尿病及其并发的肾病、神经病变等多种慢性并发症中的治疗作用均较好。本研究主要探讨葛根素在DCI大鼠治疗中的作用及机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：无特定病原体(SPF)级健康雄性Sprague-Dawley大鼠65只，周龄为7～8周，体重200～240 g，平均(224.36±6.73)g，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0006。将大鼠每笼5只饲养于动物房内以适应环境，室内温度设定为23～25 ℃，空气相对湿度设定为50%～60%，自然光照，安静，通风良好，大鼠自由摄入标准颗粒饲料和清洁饮水，定期打扫鼠笼并消毒，饲养时间为5 d。

1.2 主要药品与试剂：高脂高糖饲料(猪油∶蔗糖∶胆固醇∶基础饲料=20∶20∶5∶155)，购自北京博泰宏达生物技术有限公司；链脲佐菌素(STZ)，CAS号：18883-66-4，货号：LM-25467S，纯度≥98%(HPLC)，规格：每瓶1 g，购自上海联迈生物工程有限公司，用pH=4.2的0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液溶解，配成2.7 mg/mL STZ溶液，现用现配。葛根素，CAS号：3681-99-0，纯度：99%，货号：CFN99169，生产批号：20190125，购自武汉中标科技有限公司，采用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成浓度为4.0 mg/mL、8.0 mg/mL的葛根素混悬液，现用现配。西洛他唑片(国药准字H10960014，批号：20190524，浙江大冢制药有限公司)，研磨后采用0.5%CMC-Na配成浓度为1.67 mg/mL的西洛他唑混悬液，现用现配。2.5%戊二酸固定液、磷酸盐缓冲液(PBS)、含吐温-20的Tris缓冲盐水(TBST)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，购自北京百奥莱博科技有限公司；醋酸双氧铀-柠檬酸铅染液，购自海德创业(北京)生物科技有限公司；3%过氧化氢、脑源性神经营养因子(BDNF)免疫组化试剂盒、3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，购自上海雅吉生物科技有限公司；RIPA裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜，购自哈尔滨新海基因检测有限公司；二奎琳甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒，购自上武汉纯度生物科技有限公司；兔抗蛋白激酶B(Akt)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、突触素-1(SYN1)、肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体，购自爱必信(上海)生物科技有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒，购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.3 主要仪器设备：Morris水迷宫，成都泰盟软件有限公司；KD-2258型石蜡切片机，购自上海光学仪器厂；EM UC6型超薄切片机，购自德国Leica公司；CM-120型透射电子显微镜，购自荷兰Philips公司；CX21型光学显微镜，购自日本Olympus公司；TE70X型半干转印电泳仪，购自美国Hoefer公司。

1.4 方法

1.4.1 造模及实验方法[6]：大鼠经Morris水迷宫检测确定无认知功能障碍后随机分为对照组10只和造模组55只。造模组采用高脂高糖饲料喂养8周，对照组采用标准颗粒饲料喂养8周，然后所有大鼠禁食不禁水12 h，造模组腹腔注射2.7 mg/mL STZ溶液10 mL/kg，对照组腹腔注射等体积pH=4.2的0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，继续前8周的喂养方式，3 d后采集尾静脉血测定随机血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L视为2型糖尿病模型复制成功。成功后各组大鼠继续前8周的喂养方式，4周后，采用Morris水迷宫对大鼠的学习记忆能力进行评估，判断DCI模型是否建立成功。将造模成功的48只大鼠随机分为模型组、葛根素低剂量组、葛根素高剂量组及西洛他唑组，各12只。模型组、对照组分别灌胃给予0.5%CMC-Na；葛根素低、高剂量组分别灌胃给予4.0 mg/mL、8.0 mg/mL葛根素混悬液；西洛他唑组灌胃给予1.67 mg/mL西洛他唑混悬液。所有大鼠的给药体积均为10 mL/kg，每天1次，连续12周。

1.4.2 Morris水迷宫试验：定位航行试验，将各组大鼠分别自Morris水迷宫四个象限分别置于水中，记录逃避潜伏期(大鼠找到平台所需时间)，如90 s内大鼠没能找到平台，则将其放置于平台上，逃避潜伏期记为90 s，每天4次，连续训练4 d。空间探索实验，第5 d，撤掉平台，将大鼠从前4天的位置放入水中，观察记录其逃避潜伏期、穿越平台次数及平台象限逗留时间。

1.4.3 标本采集与处理：Morris水迷宫试验结束后，断头处死大鼠，于冰上迅速分离海马CA1区组织，其中1/3置于4 ℃ 2.5%戊二醛内进行16 h固定，取出用PBS冲洗15 min×3次，置于4℃1%戊二醛内3h，PBS冲洗15 min×3次，经乙醇脱水、环氧丙烷置换、树脂包埋后，恒温70℃烘烤，以备电镜观察；另外1/3海马组织置于4%多聚甲醛内进行24 h固定，经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，用切片机制成石蜡切片，以备免疫组化染色；剩余海马组织保存于-80 ℃冰箱，以备蛋白质印迹(Western-blot)法检测。

1.4.4 电子显微镜观察海马突触界面结构：取树脂包埋的组织切块，切制70 nm超薄切片，采用醋酸双氧铀-柠檬酸铅染液进行染色，在电子显微镜下观察突触并采集图像，采用IPP Image Pro Plus 6.0软件对图像进行分析，每张切片选择15～30个突触，观察突触活性区(SAZ)长度、突触间隙宽度和突触后致密物(PSD)厚度。

1.4.5 免疫组化法观测海马BDNF表达水平：取海马组织石蜡切片，常规经二甲苯脱蜡、乙醇水化，置于3%过氧化氢内10 min除去内源性过氧化物酶，蒸馏水洗片5 min×2次，置于37℃酶解抗原修复缓冲液内震荡15 min进行抗原修复，于切片上滴加血清封闭15 min，按照免疫组化染色试剂盒说明书，将切片依次采用一抗工作液孵育16 h(4 ℃)、生物素化二抗工作液孵育40 min(37 ℃)、SABC复合物孵育40 min(37 ℃)，之后采用DAB试剂盒显色，自来水冲洗终止，然后用苏木素染液复染，自来水返蓝完成染色，最后常规经乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。在光学显微镜对染色结果进行观察、拍照，每张切片随机选择5个400倍视野，采用Image Pro Plus 6.0软件分析全视野面积、阳性细胞面积，BDNF表达的灰度值=阳性细胞面积/全视野面积×100%，取平均值。

1.4.6 Western-blot法检测大鼠海马Akt、CREB、SYN1表达水平：取冻存海马组织250 mg，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液300 μL，匀浆器充分匀浆后，于冰上进行30 min裂解，之后4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定；采用SDS-PAGE试剂盒制备10%分离胶和4%浓缩胶，分别固定在电泳仪上；取蛋白提取液，与5×上样缓冲液混匀并煮沸5 min，每孔5μL进行上样；以浓缩胶80 V、分离胶120 V的条件电泳至溴酚蓝跑出凝胶底部；通过转膜仪将蛋白条带转到PVDF膜上，TBST 5 min后，将其置于5%脱脂奶粉内1h进行封闭；然后转移到含有1∶200稀释的Akt、CREB、SYN1及1∶4 000稀释的内参β-actin一抗工作液中，4 ℃孵育16 h，用TBST洗15 min×3次；置于1∶3 000稀释的HRP标记山羊抗兔二抗工作液中，室温孵育1h，结束后用TBST洗15 min×3次，最后通过ECL试剂盒显色、曝光、定影。采集各蛋白条带图像，用Image Pro Plus 6.0软件分析Akt、CREB、SYN1及β-actin条带的灰度值，计算Akt、CREB、SYN1相对内参β-actin的表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及平台象限逗留时间比较：与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数显著减少，平台象限逗留时间显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组大鼠逃避潜伏期较短，穿越平台次数较多，平台象限逗留时间较长，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及平台象限逗留时间比较

2.2 各组大鼠海马SAZ长度、突触间隙宽度和PSD厚度比较：与对照组比较，模型组大鼠海马SAZ长度、PSD厚度明显降低，突触间隙宽度显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组大鼠海马SAZ长度、PSD厚度较高，突触间隙宽度较短，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2与图1。

图1 各组大鼠海马突触界面结构(电子显微镜×40 000)

表2 各组大鼠海马SAZ长度、突触间隙宽度和PSD厚度比较

2.3 各组大鼠海马BDNF表达水平比较：免疫组化染色结果显示，与对照组比较，模型组大鼠海马BDNF表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组大鼠海马BDNF表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，图2。

2.4 各组大鼠海马Akt、CREB、SYN1表达水平比较：与对照组比较，模型组大鼠海马Akt、CREB、SYN1表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组大鼠海马Akt、CREB、SYN1表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组大鼠海马BDNF表达情况(免疫组化×400)

表3 各组大鼠海马BDNF表达水平比较

3 讨论

糖尿病认知功能障碍 (DCI)的发病机制尚未明确，目前大部分研究认为其涉及胰岛素抵抗(IR)、信号转导通路障碍、晚期糖基化终产物(AGEs)过度产生、线粒体功能异常、氧化应激反应、慢性炎症损伤、自噬等多个方面[7]。DCI的主要表现为记忆、学习等认知功能减退，而人类陈述记忆的基础结构组织为海马，海马神经元突触的可塑性是形成认知功能的生物学基础。突触的可塑性包括结构和电生理两个方面，有研究发现[8]，海马神经突触变性、数目减少、间隙不清、传递效率异常等可塑性损伤是引发DCI的重要病理机制。高明等[9]的实验研究发现，通过有效提高海马CA1区突触、囊泡数目及促进突触素表达，来增加改善海马突触可塑性，在糖尿病模型小鼠认知功能的提升中有重要意义。因此，可以将突触可塑性作为DCI治疗的新靶点进行研究。

本次研究采用高脂高糖饲料喂养联合一次性链脲佐菌素腹腔注射的方法成功复制了DCI大鼠模型，之后分别给予不同剂量葛根素灌胃治疗。葛根素属于8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羟基异黄酮物质，在中药葛根中含量最高，药理活性广泛，其可以通过降糖、减轻IR、抗氧化应激、胰岛β细胞保护、抑制AGEs形成、抑制蛋白质非酶糖基化反应等多种药理途径干预糖尿病及其并发症的进展[10]。在DCI的防治中，郝宏铮等[11]研究认为，葛根素能通过下调海马组织胰岛素受体底物表达来激活磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路，进而抑制相关IR和炎症反应，保护糖尿病大鼠海马神经元及认知功能。此次Morris水迷宫试验结果发现，与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组大鼠逃避潜伏期较短，穿越平台次数较多，平台象限逗留时间较长。逃避潜伏期长短与大鼠空间学习记忆能力负相关，穿越平台次数和平台象限逗留时间主要反映空间定位能力，该结果证实葛根素能有效减轻DCI认知功能障碍，而且药物剂量越高，作用效果越明显。另外，有报道称[12]，葛根素可以通过提高海马长时程增强诱导率及单刺激诱发的群峰电位幅值，来提高神经突触传递效能，改善突触可塑性减轻大鼠的学习、记忆障碍。本次电镜观察海马CA1区突触界面结构显示，与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组海马SAZ长度、PSD厚度较高，突触间隙宽度较短，表明葛根素确实可以明显改善DCI大鼠海马突触可塑性，从而提高认知功能。

DCI发生发展过程中有多种信号通路的参与，其中Akt-CREB信号通路在新突触形成、神经元再生、学习记忆活动等过程中有重要的调节作用[13]。Akt是胰岛素信号通路下游的效应因子，可以被胰岛素、胰岛素生长因子激活，然后作用于CREB，促进CREB磷酸化；CREB被激活后，可以调控、促进包括BDNF、SYN1在内的多种下游学习记忆相关蛋白、突触可塑性蛋白表达，提高认知功能。机体患糖尿病时，Akt活性降低，Akt-CREB信号通路被抑制，有研究发现，激活海马PKA(Akt)-CREB信号通路有助于改善DCI模型大鼠认知功能[14]。BDNF可以调节神经细胞生长、存活，表达水平升高能抑制神经凋亡，使神经可塑性增加，进而提高学习记忆能力；SYN1分布于突触囊泡上，属于突触的特征性膜蛋白，和突触的结构、功能有十分密切的关系，其表达水平可以反映突触的数目多寡[15]。本研究结果显示，与模型组比较，葛根素低、高剂量组和西洛他唑组大鼠海马BDNF表达水平较高，海马Akt、CREB、SYN1表达水平较高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且葛根素干预组呈现一定量效关系，表明葛根素能上调海马Akt、CREB、SYN1、BDNF表达，这可能是葛根素改善海马突触可塑性，减轻DCI大鼠认知障碍的作用机制之一。