3,3′二吲哚甲烷对围产期缺血缺氧性脑病新生大鼠的保护作用

石 凯，赵海兵，王 锐

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿死亡的主要原因，还可引起长期的神经后遗症，如认知障碍、行为障碍或记忆问题。目前，亚低温治疗HIE有一定疗效，但治疗时间窗太窄，无法及时启动[1]。因此，迫切需要探索新的有效的治疗方法，以减少HIE的脑损伤和神经后遗症。许多研究报道称HIE发病机制很复杂，如凋亡、自噬、兴奋性毒性、氧化应激和炎症[2]。此外，有研究表明缺血缺氧会引起脑白质损伤，并可能导致脱髓鞘[3]。新生儿脑白质损伤可导致脑瘫、运动和认知障碍[4]。白质约占人类大脑体积的60%,它主要由束状轴突和胶质细胞组成，包括产生髓鞘的少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。髓鞘再生是成人中枢神经系统损伤后脱髓鞘轴突周围产生新的髓鞘的过程。它是脑损伤后脑白质修复的重要再生机制之一。少突胶质细胞祖细胞(OPCs)分化为成熟的少突胶质细胞在髓鞘再生中起着重要作用。研究已经证实，在缺血性脑卒中中，OPCs向少突胶质细胞谱系分化，但这些细胞大多数未能发育为成熟的、有功能的少突胶质细胞[5]，从而导致脑白质恢复没有改善。因此，促进OPCs分化为成熟少突胶质细胞和增强轴突髓鞘再生后脑白质损伤的恢复是改善HIE预后的一种有前景的治疗方案。3,3′二吲哚甲烷(DIM)是一种选择性芳香烃受体调节剂，存在于十字花科蔬菜，如西兰花、抱子甘蓝和卷心菜中。研究表明，DIM的神经保护潜能已在帕金森病和脑出血中得到证实[6-7]。但DIM对HIE的影响尚不清楚。本研究的主要目的是DIM是否能够缓解HIE大鼠模型的脑损伤和神经功能缺损，并探讨其机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料:DIM购自Sigma-Aldrich公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司；引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM II PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；髓鞘碱性蛋白(MBP)、少突胶质细胞前体细胞血小板源性生长因子-α受体(PDGFR-α)、少突胶质细胞转录因子2(Olig2)、成熟少突胶质细胞标记物(APC)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、p-CaMKⅡ、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、p-STAT3一抗均购自美国Stanta Cruz Biotechology公司；HRP标记二抗、Cy3红色荧光二抗、Dylight 488绿色荧光二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司；激光共聚焦荧光显微镜购自日本Olympus公司；光学显微镜购自德国Leica公司；Morris水迷宫视频跟踪系统购自北京众实迪创科技公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物：妊娠14 d的SD孕鼠，来源于宁夏医科大学实验动物中心(SCXK2015-0013)，饲养在温度为(23±2)℃，湿度为50%～65%，12 h光照/黑暗循环的动物房中，允许动物自由获得水和食物。动物实验均根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南的建议进行。所有动物实验均经我院动物伦理委员会批准。

1.2.2 构建动物模型和分组：将孕SD大鼠随机分为假手术组和模型组。模型组孕鼠通过结扎在体妊娠足月孕大鼠双侧子宫动脉构建HIE动物模型，在妊娠第20 d麻醉孕鼠。中线剖腹手术后，暴露子宫动脉并结扎双侧子宫动脉，20 min后恢复子宫动脉血供。接下来将子宫放回腹腔，缝合皮肤切口。动物在4～8 h内苏醒恢复，并可以自由获得水和食物。假手术组未结扎双侧子宫动脉。孕鼠全部自然分娩，出生后将模型组新生大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组(腹腔注射尼莫地平0.4 mg/kg)、DIM高剂量组(腹腔注射DIM 20 mg/kg)、DIM低剂量组(腹腔注射DIM 10 mg/kg)。假手术组和模型对照组注射等量的生理盐水,均连续注射7 d，然后在麻醉下处死并提取脑组织，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定进行组织切片实验，另一部分储存于-80 ℃冰箱中用于RT-qPCR和Western blotting实验。

1.2.3 Morris水迷宫实验：各组于大鼠出生后4周进行Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。迷宫是一个圆形水池(直径160 cm，深60 cm)，在第二象限有一个可移动的圆柱形平台，在平台表面上方1.5 cm处装满温水(23±2)℃。测试分为两个阶段：前5 d进行定向导航实验，第6 d 进行空间搜索实验。定向导航实验：每天在同一时间进行4次训练，间隔30 min，连续5 d。每次将大鼠随机放置一个象限中，使其被迫寻找平台，记录大鼠平均逃避潜伏期。如果大鼠在90 s内未能找到平台，它将被引导至平台并停留20 s，逃避潜伏期记录为90 s。第6 d 进行空间搜索试验，移除平台，将大鼠从第四象限释放后允许其游泳90 s。记录大鼠在90 s内穿过原平台的次数。

1.2.4 HE染色：将大鼠麻醉后，解剖心脏，灌注0.9%生理盐水和4%多聚甲醛(各100 mL)，之后解剖脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。脑组织石蜡包埋，切片(5 μm)。然后根据说明书使用HE染色试剂盒对脑组织进行染色。最后使用光学显微镜观察脑组织中的病理变化。

1.2.5 RT-qPCR实验：使用TRIzol试剂从大鼠胼胝体脑组织中提取总RNA。使用逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR® Premix Ex TaqTM II PCR试剂盒以cDNA为模板进行PCR反应，反应条件为94 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，一共40个循环。使用2-ΔΔCT确定目标基因的相对表达水平。β-actin为内部对照。引物序列如下：MBP 上游：5′-ACACACGAGAACTACCCATTATCG-3′，下游：5′-AGAAATGGACTACTGGGTTTTCATCT-3′。β-actin 上游：5′-GGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3′，下游：5′-TGTCGTCCCAGTTGGTAACA-3′。

1.2.6 Western blotting：使用蛋白质提取试剂盒从大鼠胼胝体脑组织中提取总蛋白。使用BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。将蛋白质在12% SDS-PAGE凝胶电泳上分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜用5%脱脂牛奶溶液封闭，并用CaMKⅡ(1∶500)、p-CaMKⅡ(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)抗体在TBST中稀释于4 ℃过夜。然后清洗膜3次，将膜与二抗(1∶2 000)在室温下孵育1 h。用Super Signal West Pico化学发光底物检测免疫反应性，并用Image J软件进行定量。

1.2.7 免疫荧光染色实验：将大鼠麻醉后，使用0.9%生理盐水和4%多聚甲醛连续灌注大鼠，取鼠脑在4%多聚甲醛中固定48 h，然后在2.5%琼脂糖中包埋，制作脑切片，用0.5% Triton X-100渗透脑切片，然后在胎牛血清中孵育1 h。将脑切片与一抗(PDGFR-α、Olig2、APC)(1∶500)在4 ℃下孵育过夜，随后与Cy3红色荧光二抗、Dylight 488绿色荧光二抗在室温下孵育2 h。另外，将脑切片与MBP一抗(1∶500)在4 ℃下孵育过夜，然后与Cy3标记的荧光二抗在室温下孵育1 h，接下来用DAPI在室温下避光孵育5 min。最后采用激光共聚焦荧光显微镜进行观察并采集具有代表性的图像。

2 结果

2.1 DIM对HIE新生大鼠学习认知能力的影响:Morris水迷宫实验结果显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少(P<0.05)；与模型对照组比较，DIM低、高剂量组和阳性对照组大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增加(P<0.05)；与DIM低剂量组比较，DIM高剂量组和阳性对照组大鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加(P<0.05)；与阳性对照组比较，DIM高剂量组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较

2.2 DIM对HIE新生大鼠脑白质病理学变化的影响:HE染色结果显示，假手术组胼胝体细胞排列正常，结构清晰。模型组大鼠脑白质区胼胝体组织结构疏松，细胞水肿。与模型对照组比较，DIM低、高剂量组和阳性对照组剂量组大鼠脑白质区胼胝体组织结构较整齐，细胞水肿减少。与DIM低剂量组比较，DIM高剂量组和阳性对照组大鼠脑白质区胼胝体组织结构较完整，细胞轻度水肿，见图1(封二)。

2.3 DIM对HIE新生大鼠胼胝体中MBP mRNA和蛋白水平的影响:RT-qPCR和Western blotting结果显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠胼胝体中MBP mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)；与模型对照组比较，DIM低、高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中MBP mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05)；与DIM低剂量组比较，DIM高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中MBP mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)；与阳性对照组比较，DIM高剂量组大鼠胼胝体中MBP mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05),见图2(封二)。

2.4 DIM对HIE新生大鼠胼胝体中MBP表达的影响:免疫荧光染色结果显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠胼胝体中MBP表达显著降低；与模型对照组比较，DIM低、高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中MBP表达显著升高；与DIM低剂量组比较，DIM高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中MBP表达升高；与阳性对照组比较，DIM高剂量组大鼠胼胝体中MBP表达无差异,见图3(封二)。

2.5 DIM对HIE新生大鼠胼胝体少突胶质细胞成熟的影响:免疫荧光实验观察少突胶质细胞标记物Olig2和少突胶质细胞前体细胞标记物PDGFR-α或成熟少突胶质细胞标志物APC在胼胝体的分布，结果显示，与假手术组比较，模型对照组胼胝体中PDGFR-α表达显著升高，APC表达显著降低；与模型对照组比较，DIM低、高剂量组和阳性对照组胼胝体中PDGFR-α表达显著降低，APC表达显著升高； 与DIM低剂量组比较，DIM高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中PDGFR-α表达降低，APC表达升高；与阳性对照组比较，DIM高剂量组大鼠胼胝体中PDGFR-α和APC表达无差异，见图4(封二)。

2.6 DIM对HIE新生大鼠胼胝体中CaMKII/STAT3信号通路蛋白表达的影响:Western blotting结果显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠胼胝体中p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平显著升高(P<0.05)，CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)；与模型对照组比较，DIM低、高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05)，CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)； 与DIM低剂量组比较，DIM高剂量组和阳性对照组大鼠胼胝体中p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)，CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)；与阳性对照组比较，DIM高剂量组大鼠胼胝体中p-CaMKⅡ、p-STAT3 、CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图5(封二)。

3 讨论

胎儿或新生儿期缺氧缺血性脑损伤是新生儿死亡和神经功能缺损的主要因素。目前HIE多采用低温治疗，但效果并不理想。许多患儿会产生永久性的神经系统后遗症，如运动障碍、智力障碍等。

最近的研究表明，DIM是吲哚-3-甲醇的二聚体，具有抗氧化、抗癌以及神经保护作用[8]。有报道称，DIM能抑制缺氧诱导的心肌细胞炎症和细胞凋亡[9]。此外，DIM可以保护神经细胞免受缺血的影响[10]。以上研究说明DIM对缺血缺氧导致损伤的细胞具有保护作用。本研究通过结扎在体妊娠足月孕大鼠双侧子宫动脉构建HIE动物模型，研究DIM在新生儿神经系统疾病HIE中的作用。通过Morris水迷宫实验评估空间学习和记忆能力，结果发现DIM处理后改善了缺血缺氧诱导的新生大鼠空间学习记忆障碍，表明DIM可能对HIE引起的学习记忆障碍有治疗作用。

越来越多的研究报道称白质损伤是多神经系统损伤的主要病理改变之一[11]。此外，随着对脑白质在学习、记忆、情感等复杂脑功能中的深入研究，减少白质损伤成为进一步促进神经系统损伤后功能恢复的潜在目标[12]。本研究通过HE染色发现DIM可以减少HIE新生大鼠白质损伤，进一步通过Western blotting、RT-qPCR和免疫荧光实验发现DIM可以改善HIE新生大鼠髓鞘损伤，增加髓鞘蛋白MBP的表达，减少脱髓鞘。大量研究表明，减少髓鞘丢失和促进少突胶质细胞成熟是改善脱髓鞘损伤的潜在机制[13]。少突胶质细胞发育的高峰在出生后2～6周，通过少突胶质前体细胞的增殖和分化，形成成熟的少突胶质细胞，发挥髓鞘化功能[14]。新生儿HIE的发病包含少突胶质细胞发育阶段。早期适当的干预可以从一定程度上减少对少突胶质细胞发育的损害，从而挽救髓鞘形成过程，减少相关后遗症的发生[15]。本研究结果显示，HIE新生大鼠胼胝体PDGFR-α表达升高，表明HIE阻止了少突胶质细胞的成熟，使其处于不成熟状态。此外，对Olig2和成熟少突胶质细胞的标记物APC进行双染色，以评估HIE后少突胶质细胞的成熟情况。最终结果表明DIM可以促进少突胶质细胞的成熟，这对神经系统功能的恢复提供了很大帮助。

CaMK Ⅱ是突触发生、突触可塑性、学习和记忆的调节剂。当缺氧缺血发生时，细胞内游离的Ca2+增加，导致Ca2+/钙调素复合物结合，进一步激活CaMK Ⅱ[16]。Wei等人证实抑制CaMK Ⅱ能降低缺血性脑卒中大鼠氧化应激水平[17]。STAT3在脑损伤的发生发展中也起着关键作用，抑制STAT3的磷酸化可具有神经保护作用[18]。研究报道称，STAT3可被其上游激酶CaMK Ⅱ激活。IL-6通过激活CaMK Ⅱ-STAT3通路参与了缺氧诱导有丝分裂因子引起的心肌肥厚[19]。本研究结果发现，在HIE后CaMKⅡ和STAT3蛋白量不变，p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平显著升高，说明HIE处理促进了STAT3/CaMK Ⅱ通路蛋白的活性。而DIM治疗显著逆转这一结果表明,DIM可能通过抑制STAT3/CaMK Ⅱ通路发挥神经保护作用。

综上所述，本研究结果表明DIM对缺氧缺血性脑损伤具有重要的神经保护作用。DIM可通过促进少突胶质细胞成熟和改善髓鞘化，减轻新生大鼠HIE后的脑白质损伤，改善HIE新生大鼠的认知功能，这些保护作用可能与抑制CaMK Ⅱ-STAT3通路有关。