杨梅苷对高糖环境下视网膜微血管内皮细胞的保护作用及其调控机制

2022-08-10刘茜刘长庚李海军董仰曾张颖

中华实验眼科杂志 2022年7期

刘茜刘长庚李海军董仰曾张颖

河南省人民医院眼科郑州大学人民医院眼科河南省立眼科医院河南省眼科研究所，郑州 450003

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是主要的致盲眼病之一，视网膜血管病变与视网膜神经退行性病变是其主要病理改变。DR是由于长期血糖升高诱发视网膜及其相邻组织微环境改变引起的眼部并发症，其发生和发展与高糖环境、组织缺氧、氧化应激损伤和慢性炎症过程诱发相关信号通路基因表达和功能异常有关。杨梅苷属于天然多酚羟基黄酮苷类黄酮化合物，其主要存在于杨梅果实和树皮中，具有抗炎和抗氧化作用，可抑制SN4741小鼠多巴胺能神经细胞凋亡及氧化应激损伤，从而延缓帕金森病进展。研究表明，杨梅素类衍生物能够减轻过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤。基于以上研究推测杨梅苷可对DR视网膜组织损伤发挥保护作用，但目前杨梅苷对DR患者视网膜的具体作用及其机制尚不清楚。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种以共价闭合环状为特征的非编码RNA。近年来越来越多的研究发现，circRNA在DR中表达异常，并可能作为DR治疗的潜在靶点。上调circZNF292表达量可通过与mircoRNA-23b-3p(miR-23b-3p)竞争调控抑制晶状体上皮细胞凋亡从而减轻细胞损伤。Zhao等研究发现，持续高糖环境刺激人视网膜血管内皮细胞miR-23b-3p表达量升高，而降低miR-23b-3p表达可减少细胞凋亡。以上研究结果提示circZNF292/miR-23b-3p可能参与DR的发生和发展过程。本研究拟探讨杨梅苷衍生物对高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)的保护作用及其分子机制，以期为DR发病机制研究及临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞来源 HRMECs购自美国ATCC。

主要试剂及仪器杨梅苷(纯度≥98%，上海康朗生物科技有限公司)；DMEM培养液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(上海碧云天生物技术有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒、荧光素酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；丙二醛(malondialedhyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Trizol试剂、cDNA合成试剂、qRT-PCR试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；Lipofectamine3000转染试剂(美国Invitrogen公司)；miR-NC、miR-23b-3p mimics、pcDNA、pcDNA-circZNF292、circZNF292小干扰RNA(siR-circZNF292)、siR-NC(上海吉玛制药技术有限公司)；兔抗人B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)一抗(sc-7382)、兔抗人bcl-2相关X蛋白(bcl-2 associated X protein，bax)一抗(sc-7480)、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(sc-69786)(美国Santa Cruz公司)。流式细胞仪(BDC6,北京艾格斯生物科技有限公司)；凝胶扫描系统(Gel Doc XR+，美国Bio-Rad公司)；Nanodrop 2000c紫外分光光度计(美国Thermo Fisher科技公司)；实时荧光定量PCR仪(7500，美国ABI公司)。

1.2 方法

细胞分组及培养将HRMECs以3×10个/孔接种于96孔板，并分为5个组：正常对照组细胞于含5.5 mmol/L D-葡萄糖和体积分数10%FBS的DMEM培养基培养24 h；高糖组细胞于含25 mmol/L D-葡萄糖和10%FBS的DMEM培养基培养24 h；12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml杨梅苷组细胞分别在含12.5 μg/ml、25.0 μg/ml和50.0 μg/ml杨梅苷的高糖培养基培养24 h。

转染液的制备及细胞转染 (1)脂质体转染液配制用不含FBS的DMEM培养液分别稀释pcDNA、pcDNA-circZNF292、siR-circZNF292和siR-NC至终浓度为0.5 μmol/L，室温孵育5 min作为A液；向200 μl不含FBS的DMEM培养液中加入16 μl Lipofectamine3000转染试剂并充分混合作为B液，A液与B液充分混匀后室温孵育20 min。(2)细胞分组转染将细胞以2×10个/ml密度接种于6孔板，分为高糖+pcDNA组和高糖+pcDNA-circZNF292组，取16 μl相应脂质体转染混合液加入400 μl HRMECs培养液中培养6 h后弃上清液，加入正常培养液继续培养48 h，更换为含25 mmol/L D-葡萄糖的DMEM完全培养基培养24 h。将细胞分为高糖+杨梅苷+siR-NC组和高糖+杨梅苷+siR-circZNF292组，分别取20 μl siR-NC、siR-circZNF292脂质体转染混合液加入400 μl HRMECs培养液中培养6 h后弃上清液，加入正常培养液培养48 h，更换为含50 μg/ml杨梅苷和25 mmol/L D-葡萄糖的DMEM完全培养基培养24 h。

流式细胞术检测细胞凋亡率参照文献[15]中的方法，取各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心半径10 cm，3 000 r/min离心6 min，弃上清，预冷磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)洗涤，离心弃上清后加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光振荡10 min，应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

酶联免疫吸附测定法检测细胞中MDA浓度及SOD活性参照文献[16]中的方法，胰蛋白酶消化收集各组细胞，采用反复冻融法裂解细胞并形成匀浆液，取0.1 ml匀浆液加入离心管，分别加入0.2 ml MDA或SOD工作液，水浴冷却，室温条件下1 000 r/min离心10 min收集上清液，于96孔板中每孔加200 μl上清液和100 μl工作液，充分混匀，同时设置样品孔与空白对照孔，应用酶标仪分别检测MDA浓度及SOD活性。

实时荧光定量PCR法检测细胞中circZNF292及miR-23b-3p相对表达量参照文献[17]中的方法，收集各组细胞，加入Trizol试剂1 ml，采用总RNA提取试剂盒提取RNA，

为1.6～1.8，将RNA逆转录为cDNA，以2 μl cDNA进行扩增(扩增反应体系25 μl)，反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环。

circZNF292

正向引物序列为5'-GAGACTGGGGTGTGG AAAAA-3'，反向引物序列为5'-CGGGCTTTAACATAAC TTTGG-3'；

miR-23b-3p

正向引物序列为5'-GGG ATCACATTGCCAGGGAT-3'，反向引物序列为5'-CAGT GCGTGTCGTGGAGT-3'。GAPDH正向引物为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3',反向引物为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3';U6正向引物为5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向引物为5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

circZNF292

基因扩增以GAPDH为内参，

miR-23b-3p

基因扩增以U6为内参，采用2法计算各目的基因相对表达量。

双荧光素酶报告实验检测HRMECs中circZNF292与miR-23b-3p的靶向关系采用Starbase预测circZNF292与miR-23b-3p的结合位点，用分子克隆的方法分别将结合位点克隆至pGL3质粒中构建野生型(wild type，WT)载体WT-circZNF292，采用点突变试剂盒结合突变位点后构建含有突变位点的突变型(mutant type，MUT)载体MUT-circZNF292，将WT-circZNF292、MUT-circZNF292分别与miR-NC或miR-23b-3p mimics共转染至HRMECs，培养48 h后用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞的荧光素酶活性。

Western blot法检测HRMECs中bax、bcl-2蛋白相对表达量参照文献[18]中的方法，收集各组细胞，PBS洗涤，加入500 μl RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度。取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，将分离的蛋白凝胶转印至PVDF膜，置于质量分数5%脱脂牛奶封闭液中室温封闭2 h；加入bax(1∶ 800)、bcl-2(1∶ 800)一抗及GAPDH抗体(1∶ 1 000)4 ℃孵育过夜，PBST漂洗后加入相应二抗(1∶ 3 000)37 ℃孵育1 h，PBST漂洗后ECL发光显影。采用Quantity One软件对蛋白条带进行灰度值分析，以目的蛋白与内参GAPDH蛋白灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件(美国IBM SPSS公司)进行统计分析。本研究中计量资料经S-W检验证实呈正态分布，以表示，2个组间双荧光素酶报告检测结果差异比较采用独立样本

检验，多组间细胞凋亡率、相关蛋白表达量、MDA浓度及SOD活性总体差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-

检验。

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量杨梅苷处理组细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达量比较

正常对照组细胞中bax蛋白条带灰度最弱，bcl-2蛋白条带灰度最强；与正常对照组比较，高糖组细胞中bax条带灰度明显增强，bcl-2条带灰度明显减弱；随着杨梅苷剂量增加，细胞中bax蛋白条带灰度逐渐减弱，bcl-2蛋白条带灰度逐渐增强(图1)。各组细胞中bax蛋白和bcl-2蛋白相对表达量及细胞凋亡率总体比较，差异均有统计学意义(

=105.707、111.835、74.515，均

<0.01)；其中与正常对照组相比，高糖组细胞bax蛋白相对表达量和细胞凋亡率明显升高，bcl-2蛋白相对表达量明显下降，差异均有统计学意义(均

<0.01)；随着杨梅苷剂量逐渐增加，细胞中bax蛋白相对表达量和细胞凋亡率逐渐下降，bcl-2蛋白相对表达量逐渐升高，不同剂量杨梅苷组间比较差异均有统计学意义(均

<0.05)(图2，表1)。

图1 不同剂量杨梅苷组细胞中bax和bcl-2蛋白表达电泳图 1：正常对照组;2：高糖组;3：12.5 μg/ml杨梅苷组;4：25.0 μg/ml杨梅苷组;5：50.0 μg/ml杨梅苷组 bax：bcl-2相关X蛋白;bcl-2：B细胞淋巴瘤-2Figure 1 Electrophoretogram of bax and bcl-2 proteins expression in HRMECs of different groups 1:normal control group;2:high glucose group;3:12.5 μg/ml myricitrin group;4:25.0 μg/ml myricitrin group;5:50.0 μg/ml myricitrin group bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma-2

图2 不同剂量杨梅苷组细胞凋亡流式细胞图高糖组凋亡细胞明显增多，随着杨梅苷剂量的增加，凋亡细胞有所减少 A：正常对照组 B：高糖组 C：12.5 μg/ml杨梅苷组 D：25.0 μg/ml杨梅苷组 E：50.0 μg/ml杨梅苷组Figure 2 Flow cytometry of cell apoptosis in different groups Apoptotic cells increased significantly in high glucose group,and the number of apoptotic cells decreased with the increase of myricitrin concentration A:normal control group B:high glucose group C:12.5 μg/ml myricitrin group D:25.0 μg/ml myricitrin group E:50.0 μg/ml myricitrin group

表1 不同剂量杨梅苷组细胞中bax和bcl-2蛋白相对表达量及细胞凋亡率比较(x±s)Table 1 Comparison of relative expression levels of bax and bcl-2 proteins and cell apoptosis rate among groups with different concentrations of myricitrin (x±s)组别样本量bax蛋白表达量bcl-2蛋白表达量细胞凋亡率(%)正常对照组30.18±0.030.80±0.067.85±0.71高糖组30.71±0.05a0.18±0.02a20.40±1.15a12.5 μg/ml杨梅苷组30.55±0.04b0.28±0.04b18.33±1.12b25.0 μg/ml杨梅苷组30.36±0.04bc0.51±0.04bc15.30±1.03bc50.0 μg/ml杨梅苷组30.23±0.02bcd0.72±0.05bcd10.31±1.22bcdF值105.707111.83574.515P值<0.001<0.001<0.001 注:与正常对照组相比,aP<0.05;与高糖组相比,bP<0.05;与12.5 μg/ml杨梅苷组相比,cP<0.05;与25.0 μg/ml杨梅苷组相比,dP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) bax:bcl-2相关X蛋白;bcl-2:B细胞淋巴瘤-2 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with high glucose group,bP<0.05;compared with 12.5 μg/ml myricitrin group,cP<0.05;compared with 25.0 μg/ml myricitrin group,dP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma-2

2.2 不同剂量杨梅苷组细胞中MDA浓度和SOD活性比较

正常对照组、高糖组及不同剂量杨梅苷组细胞中MDA浓度及SOD活性值总体比较差异均有统计学意义(

=109.651、135.020，均

<0.001)；与正常对照组比较，高糖组细胞中MDA浓度明显升高，SOD活性值明显降低，差异均有统计学意义(均

<0.05)；与高糖组比较，各不同剂量杨梅苷组细胞中MDA浓度均明显降低，SOD活性值均明显升高，且呈剂量依赖性，各不同剂量杨梅苷组间比较，差异均有统计学意义(均

<0.05)(表2)。

表2 不同剂量杨梅苷组细胞中MDA浓度和SOD活性值比较(x±s)Table 2 Comparison of MDA concentration and SOD activity among groups with different concentrations of myricitrin (x±s)组别样本量MDA浓度(mmol/L)SOD活性值[μmol/(min·L)]正常对照组3124.39±12.02207.36±12.03高糖组3350.00±22.39a47.89±4.50a12.5 μg/ml杨梅苷组3306.07±16.20b80.26±6.55b25.0 μg/ml杨梅苷组3247.74±12.45bc141.62±9.51bc50.0 μg/ml杨梅苷组3166.51±11.98bcd173.47±13.42bcdF值109.651135.020P值<0.001<0.001 注:与正常对照组相比,aP<0.05;与高糖组相比,bP<0.05;与12.5 μg/ml杨梅苷组相比,cP<0.05;与25.0 μg/ml杨梅苷组相比,dP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) MDA:丙二醛;SOD:超氧化物歧化酶 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with high glucose group,bP<0.05;compared with 12.5 μg/ml myricitrin group,cP<0.05;compared with 25.0 μg/ml myric-itrin group,dP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) MDA:malondialedhyde;SOD:superoxide dismutase

2.3 不同剂量杨梅苷组细胞中circZNF292和miR-23b-3相对表达量比较

正常对照组、高糖组及不同剂量杨梅苷组细胞中circZNF292和miR-23b-3p相对表达量总体比较差异均有统计学意义(

=219.919、116.304，均

<0.001)；与正常对照组相比，高糖组细胞中circZNF292相对表达量明显降低，miR-23b-3p相对表达量明显升高，差异均有统计学意义(均

<0.05)；与高糖组相比，各不同剂量杨梅苷组circZNF292相对表达量均明显升高，miR-23b-3p相对表达量均明显降低，且均呈现剂量依赖性，不同剂量杨梅苷组间比较，差异均有统计学意义(均

<0.05)(表3)。

表3 不同剂量杨梅苷组细胞中circZNF292和miR-23b-3p相对表达量比较(x±s)Table 3 Comparison of relative expression levels of circZNF292 and miR-23b-3p among groups with different concentrations of myricitrin (x±s)组别样本量circZNF292miR-23b-3p正常对照组31.00±0.011.00±0.06高糖组30.25±0.02a2.34±0.10a12.5 μg/ml杨梅苷组30.39±0.04b1.89±0.08b25.0 μg/ml杨梅苷组30.57±0.04bc1.60±0.06bc50.0 μg/ml杨梅苷组30.79±0.05bcd1.36±0.10bcdF值219.919116.304P值<0.001<0.001 注:与正常对照组相比,aP<0.05;与高糖组相比,bP<0.05;与12.5 μg/ml杨梅苷组相比,cP<0.05;与25.0 μg/ml杨梅苷组相比,dP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) miR:微小RNA Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with high glucose group,bP<0.05;compared with 12.5 μg/ml myricitrin group,cP<0.05;compared with 25.0 μg/ml myric-itrin group,dP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA

2.4 HRMECs中circZNF292与miR-23b-3p靶向关系验证

Starbase预测显示circZNF292与miR-23b-3p之间的互补序列中存在相互结合位点(图3)。共转染WT-circZNF292细胞中，miR-23b-3p组相对荧光素酶活性值为0.35±0.03，明显低于miR-NC组的0.96±0.09，差异有统计学意义(

=11.137，

<0.05)；而共转染MUT-circZNF292细胞中，miR-23b-3p组和miR-NC组相对荧光素酶活性值分别为0.98±0.08和1.00±0.11，差异无统计学意义(

=0.441，

>0.05)。

图3 circZNF292与miR-23b-3p序列互补关系 Starbase预测显示circZNF292与miR-23b-3p存在结合位点 WT:野生型；miR：微小RNA；MUT：突变型Figure 3 Complementary sequences of circZNF292 and miR-23b-3p Starbase prediction showed that there were binding sites between circZNF292 and miR-23b-3p WT:wild type;miR:microRNA;MUT:mutant type

2.5 不同circZNF292转染组circZNF292和miR-23b-3相对表达量以及细胞凋亡情况比较

与pcDNA组比较，pcDNA-circZNF292组细胞中circZNF292相对表达量明显升高，miR-23b-3p相对表达量明显下降，差异均有统计学意义(

=13.874、13.668，均

<0.001)。与pcDNA组比较，pcDNA-circZNF292组bax蛋白相对表达量和细胞凋亡率明显下降，bcl-2蛋白相对表达量明显升高，差异均有统计学意义(

=8.133、9.046、13.070，均

≤0.001)(图4，5，表4)。

图4 不同circZNF292转染组细胞凋亡相关蛋白表达电泳图 bax：bcl-2相关X蛋白;bcl-2：B细胞淋巴瘤-2Figure 4 Electrophoretogram of apoptosis-related protein expression in different circZNF292 transfection groups bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma-2

表4 不同circZNF292转染组circZNF292和miR-23b-3p相对表达量、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达量比较(x±s)Table 4 Comparison of relative expression levels of circZNF292 and miR-23b-3p,cell apoptosis rate and apoptosis-related protein expression between different circZNF292 transfection groups (x±s)组别样本量circZNF292miR-23b-3p凋亡率(%)baxbcl-2pcDNA组31.00±0.021.00±0.0122.63±1.430.70±0.080.19±0.03pcDNA-circZNF292组32.61±0.20a0.52±0.06a13.24±1.09a0.28±0.04a0.63±0.05at值13.87413.6689.0468.13313.070P值<0.001<0.0010.0010.001<0.001 注:(独立样本t检验) miR:微小RNA;bax:bcl-2相关X蛋白;bcl-2:B细胞淋巴瘤-2 Note:(Independent samples t test) miR:microRNA;bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma-2

2.6 不同circZNF292转染组细胞中MDA浓度和SOD活性比较

与pcDNA组比较，pcDNA-circZNF292组细胞中MDA浓度明显升高，SOD活性值明显下降，差异均有统计学意义(

=11.281、15.585，均

<0.001)(表5)。

表5 不同circZNF292转染组细胞MDA浓度和SOD活性值比较(x±s)Table 5 Comparison of MDA concentration and SOD activity between different circZNF292 transfection groups (x±s)组别样本量MDA浓度(mmol/L)SOD活性[μmol/(min·L)]pcDNA组3354.47±21.5247.82±5.65pcDNA-circZNF292组3194.21±11.93a161.20±11.02at值11.28115.585P值<0.001<0.001 注:(独立样本t检验) MDA:丙二醛;SOD:超氧化物歧化酶 Note:(Independent samples t test) MDA:malondialedhyde;SOD:super-oxide dismutase

图5 不同circZNF292转染组细胞凋亡流式细胞图 pcDNA-circZNF292组凋亡细胞数少于pcDNA组 A:pcDNA组 B:pcDNA-circZNF292组Figure 5 Flow cytometry of apoptosis in different circZNF292 transfection groups The number of apoptotic cells was smaller in pcDNA-circZNF292 group than pcDNA group A:pcDNA group B:pcDNA-circZNF292 group

2.7 不同siRNA转染组细胞凋亡情况比较

高糖组细胞中bax蛋白条带灰度最强，bcl-2蛋白条带灰度最弱；杨梅苷组和杨梅苷+siR-NC组细胞中bax蛋白条带灰度明显减弱，bcl-2蛋白条带灰度明显增强；与杨梅苷组和杨梅苷+siR-NC组比较，杨梅苷+siR-circZNF292组细胞中bax蛋白条带灰度增强，bcl-2蛋白条带灰度减弱(图6)。高糖组、杨梅苷组、杨梅苷+siR-NC组和杨梅苷+siR-circZNF292组细胞中circZNF292、miR-23b-3p、bax蛋白和bcl-2蛋白相对表达量及细胞凋亡率总体比较，差异均有统计学意义(

=163.188、107.321、85.623、59.310、96.786，均

<0.001)；其中与高糖组和杨梅苷+siR-circZNF292组比较，杨梅苷组和杨梅苷+siR-NC组细胞中miR-23b-3p、bax蛋白相对表达量和细胞凋亡率明显降低，circZNF292和bcl-2蛋白相对表达量明显升高，差异均有统计学意义(均

<0.01)(图6，7，表6)。

图6 不同siRNA转染组细胞凋亡相关蛋白表达电泳图 1：高糖组；2：杨梅苷组；3：杨梅苷+siR-NC组；4：杨梅苷+siR-circZNF292 bax：bcl-2相关X蛋白；bcl-2：B细胞淋巴瘤-2Figure 6 Electrophoretogram of apoptosis-related protein expression in different siRNA transfection groups 1:high glucose group;2:myricitrin group;3:myricitrin+siR-NC group;4:myricitrin+siR-circZNF292 bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma-2

图7 不同siRNA转染组细胞凋亡流式细胞图杨梅苷组凋亡细胞数少于高糖组和杨梅苷+siR-circZNF292组 A:高糖组 B：杨梅苷组 C：杨梅苷+siR-NC组 D：杨梅苷+siR-circZNF292Figure 7 Flow cytometry of cell apoptosis in different siRNA transfection groups The number of apoptotic cells was smaller in myricitrin group than myricitrin+siR-cirCZNF292 group A:high glucose group B:myricitrin group C:myricitrin+siR-NC group D:myricitrin+siR-circZNF292

表6 不同siRNA转染组circZNF292和miR-23b-3p相对表达量、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达量比较(x±s)Table 6 Comparison of relative expression levels of circZNF292 and miR-23b-3p,cell apoptosis rate and apoptosis-related protein expression among different siRNA transfection groups (x±s)组别样本量circZNF292miR-23b-3p凋亡率(%)baxbcl-2高糖组31.00±0.031.00±0.0122.71±1.290.69±0.060.18±0.03杨梅苷组32.97±0.15a0.46±0.05a9.98±1.07a0.24±0.02a0.71±0.05a杨梅苷+siR-NC组33.01±0.200.47±0.0410.02±1.150.23±0.020.72±0.08杨梅苷+siR-circZNF292组31.64±0.10b0.80±0.06b17.29±0.78b0.50±0.05b0.35±0.03bF值163.188107.32196.78685.62359.310P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:与高糖组相比,aP<0.05;与杨梅苷+siR-NC组相比,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) siRNA:小干扰RNA;miR:微小RNA;bax:bcl-2相关X蛋白;bcl-2:B细胞淋巴瘤-2;siR-NC:小干扰RNA-阴性对照 Note:Compared with high glucose group,aP<0.05;compared with myricitrin+siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small inter-fering RNA;miR:microRNA;bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma-2;siR-NC:small interfering RNA-negative control

2.8 不同siRNA转染组细胞中MDA浓度及SOD活性比较

高糖组、杨梅苷组、杨梅苷+siR-NC组和杨梅苷+siR-circZNF292组细胞中MDA浓度和SOD活性值总体比较，差异均有统计学意义(

=49.375、149.745，均

<0.001)。与杨梅苷+siR-NC组比较，杨梅苷+siR-circZNF292组MDA浓度明显升高，SOD活性值明显降低，差异均有统计学意义(均

<0.05)(表7)。

表7 不同siRNA转染组细胞中MDA浓度和SOD活性值比较(x±s)Table 7 Comparison of MDA concentration and SOD activity among different siRNA transfection groups (x±s)组别样本量MDA浓度(mmol/L)SOD活性值[μmol/(min·L)]高糖组3347.23±25.4348.55±5.99杨梅苷组3159.82±17.15a181.07±10.06a杨梅苷+siR-NC组3155.41±19.84186.12±9.96杨梅苷+siR-circZNF292组3254.10±25.99b133.69±9.45bF值49.375149.745P值<0.001<0.001 注:与高糖组相比,aP<0.05;与杨梅苷+siR-NC组相比,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) siRNA:小干扰RNA;MDA:丙二醛;SOD:超氧化物歧化酶;siR-NC:小干扰RNA-阴性对照 Note:Compared with high glucose group,aP<0.05;compared with myric-itrin+siR-NC group,bP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;MDA:malondialedhyde;SOD:superoxide dismutase;siR-NC:small interfering RNA-negative control

3 讨论

DR是糖尿病常见的严重眼部微血管并发症之一。高血糖状态下视网膜代谢异常，促发氧化应激和炎症反应，引发HRMECs功能障碍和细胞凋亡等病理改变，最终破坏血-视网膜屏障结构和功能的稳定性。因此，及早干预或合理治疗对防治DR的发生和发展有重要意义。

杨梅苷可促进缺氧/复氧诱导的心肌细胞增生，抑制细胞凋亡和caspase-3活性，抑制氧化应激反应，减轻心肌细胞损伤。杨梅苷通过调控bcl-2/bax信号通路，抑制大鼠脊髓外伤诱导的氧化应激损伤及炎症反应。本研究结果也显示，高糖可诱导HRMECs凋亡率和bax表达升高，抗凋亡蛋白bcl-2水平降低；随着杨梅苷剂量增加，高糖诱导的HRMECs凋亡率和bax蛋白表达降低，bcl-2蛋白表达升高，并存在剂量依赖性，提示杨梅苷可抑制高糖诱导的HRMECs凋亡。同时本研究发现，高糖诱导的HRMECs中MDA浓度升高，SOD活性降低，而杨梅苷可降低细胞MDA浓度，增强SOD活性，且呈剂量依赖性，提示杨梅苷可抑制高糖诱导的HRMECs过氧化损伤。然而，杨梅苷对高糖诱导HRMECs过氧化损伤和凋亡途径的分子机制尚不清楚。

circRNA具有稳定性、保守性和特异性，部分circRNA序列上富含多个miRNA应答元件，可结合并吸附miRNA从而调控靶基因表达。近年来越来越多的研究发现，circRNA在DR中表达异常，并可能作为DR治疗的潜在靶点。circZNF292是研究较为广泛的circRNA，其在氧化应激状态下对细胞凋亡发挥着重要的调节作用。circZNF292在氧糖剥夺诱导的心肌H9c2细胞中表达异常，并通过Wnt3a/β-catenin调控细胞增生及凋亡。circZNF292在年龄相关性白内障中表达显著下调，circZNF292表达上调可通过与miR-23b-3p竞争调控抗氧化基因表达抑制晶状体上皮细胞凋亡。本研究结果显示，高糖诱导的HRMECs中circZNF292表达量显著降低，miR-23b-3p表达量显著升高，杨梅苷能够以浓度依赖性方式升高circZNF292表达量，降低miR-23b-3p表达量，提示杨梅苷可能参与调控circZNF292/miR-23b-3p表达。本研究结果还显示，通过转染上调circZNF292表达可抑制miR-23b-3p表达，增强高糖诱导的HRMECs抗氧化能力，抑制HRMECs凋亡；同时，转染siRNA抑制circZNF292表达可升高miR-23b-3p表达，逆转杨梅苷对高糖诱导HRMECs的凋亡及抗氧化能力。双荧光素酶报告实验结果显示，HRMECs中circZNF292与miR-23b-3p存在靶向关系。以上结果提示，杨梅苷可通过上调高糖诱导的HRMECs中circZNF292表达而抑制miR-23b-3p表达，增强细胞抗氧化能力并抑制细胞凋亡。但杨梅苷是否参与调控DR的其他基因或信号通路尚需进一步研究探索。

综上所述，本研究结果显示circZNF292可靶向调控miR-23b-3p表达，circZNF292/miR-23b-3p分子轴在高糖诱导的HRMECs氧化应激损伤和细胞凋亡中发挥重要调控作用。杨梅苷可抑制高糖诱导的HRMECs凋亡并增强细胞抗氧化能力，其作用机制与促进circZNF292表达及抑制miR-23b-3p表达有关。本研究为杨梅苷治疗DR提供了一定的实验基础，后续可在DR动物模型内进一步验证其安全性和有效性。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

刘茜：参与研究选题、研究设计、研究实施、数据收集整理和分析、论文撰写修改及定稿；刘长庚：参与研究实施、数据收集整理和分析、论文修改；李海军：参与研究选题、数据分析和论文修改；董仰曾：参与研究设计、论文定稿；张颖：参与数据收集整理和分析