高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中环状RNA差异表达分析

贾杨雪 王志玲 魏莹莹 朱恺 顾永昊

1皖南医学院第二附属医院眼科，芜湖241000；2安徽医科大学附属省立医院眼科，合肥 230001

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的主要微血管并发症之一，严重影响患者视力。我国糖尿病患者中DR的总患病率约为23%。有研究显示，15年以上病程的1型和2型糖尿病患者中DR患病率分别达98%和78%。目前仍然缺乏良好的DR防治方法，探索其发病机制及可能的治疗方向显得非常重要。血管内皮细胞功能障碍和视网膜微环境的代谢变化是DR的主要发病机制之一，预防血管内皮细胞功能障碍可降低糖尿病性血管并发症的风险。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种广泛存在于真核生物体内的非编码RNA，具有高度稳定性、保守性、一定的时序及组织特异性，其主要功能包括：与微小RNA(microRNA，miRNA)竞争性结合；通过RNA结合蛋白与蛋白质相互作用；调控RNA聚合酶的转录进而调控亲本基因的表达；通过选择性剪接或碱基互补配对等方式介导假基因形成；少部分的circRNA可作为mRNA编码蛋白。越来越多的研究表明，circRNA参与肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌等疾病的病理过程，成为肿瘤早期诊断标志物及潜在的治疗靶点。另外，也有研究表明circRNA可通过调控下游靶基因表达影响胰岛β细胞的分泌功能，从而在糖尿病及其并发症的发展中发挥作用。本课题组前期应用circRNA芯片对5例增生性DR患者、5例无明显眼底病变的2型糖尿病患者和5名年龄匹配的正常人血浆进行对比研究发现，增生性DR患者血浆的circRNA谱发生明显变化，证实circRNA在DR的发病中可能发挥潜在作用。采用血浆标本进行circRNA芯片研究时，血浆内的各种成分易受身体整体情况的影响，而直接进行细胞实验可以更准确地发现高糖刺激对视网膜血管内皮细胞中circRNA表达的影响。本研究拟通过circRNA芯片筛选正常与高糖培养的人视网膜血管内皮细胞(human retinal vascular endothelial cells，HRVECs)中差异表达的circRNA，采用实时荧光定量PCR进行验证，分析其可能的靶miRNA分子，为DR的诊断和治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

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细胞来源 HRVECs购于深圳市豪地华拓生物科技有限公司。

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主要试剂及仪器 DMEM低糖(5.5 mmol/L)培养基(美国HyClone公司)；胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青-链霉素混合液(美国Gibco公司)；甘露醇试剂(上海展云化工有限公司)；Trizol试剂(美国Ambion公司)；逆转录试剂盒(美国ABclonal公司)；circRNA基因芯片(美国Arraystar公司)；SuperRed GelRed核酸染料(美国Biosearch Technologies公司)；荧光定量PCR试剂Genious 2X SYBR Green Fast qPCR(美国ABclonal公司)。低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；CO细胞培养箱、实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Nanodrop微光分光光度计(美国Thermo公司)；紫外分光光度计(上海司乐仪器有限公司)；凝胶成像仪(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.2 方法

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HRVECs的培养及分组处理 HRVECs用含体积分数10%FBS和青-链霉素混合液100 U/ml(商品单位)的DMEM低糖培养基，在37 ℃、CO体积分数5%的恒温CO培养箱中培养并传代，每2～3 d换液1次。待细胞生长至80%融合度，将细胞进行传代并分组培养：正常对照组细胞于5.5 mmol/L葡萄糖培养基中培养，高渗对照组细胞于19.5 mmol/L甘露醇以及5.5 mmol/L葡萄糖培养基中培养，高糖组细胞于25 mmol/L葡萄糖培养基中培养。各组细胞均在37 ℃细胞恒温培养箱中培养24 h。实验独立重复3次。

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circRNA芯片检测细胞中circRNA表达及差异基因筛选 将正常对照组和高糖组细胞用预冷磷酸盐缓冲液洗涤3次后，加入Trizol裂解细胞，提取样品中的总RNA，用紫外分光光度计测定核酸的纯度及浓度，要求

A

/A

值为1.8～2.0，RNA总量达到500 μg。用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。由上海康成生物工程有限公司采用circRNA芯片V2.0进行检测，将正常对照组和高糖组抽提的总RNA用RNase R处理，使用Arraystar Super RNA Labeling试剂盒，逆转录合成cDNA并进行荧光标记。采用Nanodrop检测荧光标记效率，在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片进行杂交，采用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，采用GenePix Pro6软件将实验结果转换成数字型数据保存。采用R软件limma包对原始数据进行归一化处理，根据差异倍数(fold change，FC)≥1.5或FC≤0.67且

P

<0.05筛选出2个组样本中差异表达的circRNA。

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3

实时荧光定量PCR验证差异表达circRNA 分别从上调和下调的差异表达circRNA中筛选出FC排序前3的circRNA，首先在circRNA数据库(http://www.circbase.org/)找到circRNA的全长序列，按照发散引物设计原理，跨circRNA的junction site上下游进行引物设计，确保扩增产物包含junction site。各目的circRNA的具体引物序列见表1，引物由合肥通用生物系统有限公司合成，以GAPDH为内参。收集正常对照组、高渗对照组和高糖组细胞，用Trizol处理后抽提总RNA，再进行定量逆转录得到cDNA，实时荧光定量PCR进行引物扩增。其中目的基因正向和反向引物各1 μl，cDNA 2 μl，RNase-free water 21 μl，qRT-PCR酶25 μl，共50 μl反应体系，将混合物混匀后各取15 μl至96孔板的3个复孔中，离心后置于qPCR仪中运行程序。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸34 s，共40个循环。采用熔解曲线(95 ℃1 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s)分析扩增产物特性。使用2法计算各目的基因相对表达量。

表1 PCR扩增引物序列Table 1 PCR primer sequences目的基因引物序列(5'-3')hsa_circ_0002938正向:AGCTGTTTCTCTGAGTCCTG反向:CAGGTGGATCAACTGTGATGhsa_circ_0008036正向:AAGGACGGCTCTATCAGCAT反向:GCAGATCGTCCAAGAATCTChsa_circ_0001946正向:TTGGAAGACCTTGACACAGG反向:CAGTGTGCTGATCTTCTGAChsa_circ_0035277正向:CATCTGGACACTCCAATGAC反向:ACTGTGGCACTGCCAACTCAhsa_circ_0008344正向:TCAGCTCCAGGAACCATCAT反向:CTGTACTGCACTGGTCATTGhsa_circ_0001874正向:TTGGCTCTCCTGCTGTGC反向:GGTCATCCACAATCAGCCCAGAPDH正向:CTTCATTGACCTCAACTACATGG反向:CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT 注:PCR:聚合酶链式反应;GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶 Note:PCR:polymerase chain reaction;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

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4

miRNA结合位点预测 通过数据库Circinteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)，依据结合紧密程度，预测6个差异表达最显著的circRNA分子下游可能作用miRNA靶点。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。计量资料数据经Shapiro-Wilk检验证实符合正态分布，以表示。3个组间circRNA相对表达量的总体差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-

t

检验。

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<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达circRNA的筛选

共筛选出448个差异表达的circRNA，其中182个circRNA上调，266个circRNA表达下调(图1)。10个上调最显著的circRNA分别为hsa_circ_0002938、hsa_circ_0008036、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0087862、hsa_circ_0071935、hsa_circ_0000665、hsa_circ_0073748、hsa_circ_0000740、hsa_circ_0008697和hsa_circ_0056550(表2)；10个下调最显著的circRNA分别为hsa_circ_0035277、hsa_circ_0008344、hsa_circ_0001874、hsa_circ_0082326、hsa_circ_0000858、hsa_circ_0092367、hsa_circ_0000598、hsa_circ_0049271、hsa_circ_0000253和hsa_circ_0044837(表3)。

图1 高糖组与正常对照组之间差异表达circRNA火山图(n=3) 垂直线对应0.67倍和1.5倍FC，水平线标记的P值为0.05.红色表示上调的circRNA，蓝色表示下调的circRNA FC：差异倍数Figure 1 Volcano graph of differentially expressed circRNAs between high glucose group and normal control group(n=3) The vertical lines corresponded to 0.67 and 1.5 fold change,while the horizontal line marked P value was 0.05.The red dots represented up-regulated circRNAs,and the blue dots represented down-regulated circRNAs FC:fold change

表2 排序前10的表达上调circRNATable 2 Top 10 up-regulated circRNAs基因差异倍数P值染色体编号hsa_circ_00029382.739 751 20.031 829 2chr2hsa_circ_00080362.606 675 90.040 271 3chr2hsa_circ_00019462.554 833 50.003 108 2chrXhsa_circ_00878622.554 786 60.003 164 5chr9hsa_circ_00719352.554 537 20.017 673 2chr5hsa_circ_00006652.484 067 80.010 291 4chr16hsa_circ_00737482.481 503 40.000 425 4chr5hsa_circ_00007402.439 942 40.043 060 9chr17hsa_circ_00086972.369 068 30.031 415 5chr5hsa_circ_00565502.346 626 10.005 412 1chr2 注:(配对样本t检验) circRNA:环状RNA Note:(Paired sample t-test) circRNA:circular RNA

表3 排序前10的表达下调circRNATable 3 Top 10 down-regulated circRNAs基因差异倍数P值染色体编号hsa_circ_00352770.209 494 70.486 667 8chr15hsa_circ_00083440.252 612 00.507 082 2chr9hsa_circ_00018740.257 731 70.325 160 8chr9hsa_circ_00823260.258 952 10.516 543 1chr7hsa_circ_00008580.283 102 20.553 271 4chr18hsa_circ_00923670.299 648 20.617 343 6chr15hsa_circ_00005980.322 714 10.394 815 1chr15hsa_circ_00492710.360 884 50.382 945 1chr19hsa_circ_00002530.387 327 30.609 878 7chr10hsa_circ_00448370.397 269 90.562 405 6chr17 注:(配对样本t检验) circRNA:环状RNA Note:(Paired sample t-test) circRNA:circular RNA

2.2 差异circRNA的实时荧光定量PCR验证

正常对照组、高渗对照组和高糖组3个表达显著上调circRNA(hsa_circ_0002938、hsa_circ_0008036和hsa_circ_0001946)和3个表达显著下调circRNA(hsa_circ_0035277、hsa_circ_0008344和hsa_circ_0001874)的相对表达量总体比较，差异均有统计学意义(

F

=7.571、41.274、5.249、83.106、11.011、6.593，均

P

<0.05)；正常对照组与高渗对照组中各circRNA的相对表达量比较，差异均无统计学意义(均

P

>0.05)；与正常对照组和高渗对照组相比，高糖组中hsa_circ_0002938、hsa_circ_0008036和hsa_circ_0001946相对表达量显著升高，hsa_circ_0035277、hsa_circ_0008344和hsa_circ_0001874相对表达量显著下降，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(表4)。

表4 各组细胞中差异表达circRNA相对表达量比较(x±s)Table 4 Comparison of the relative expression of differently expressed circRNAs among different groups (x±s)组别样本量hsa_circ_0002938hsa_circ_0008036hsa_circ_0001946hsa_circ_0035277hsa_circ_0008344hsa_circ_0001874正常对照组31.0001.0001.0001.0001.0001.000高渗对照组31.104±0.0531.011±0.1170.964±0.1131.043±0.0301.099±0.0661.041±0.108高糖组33.380±0.845ab1.989±0.099ab1.353±0.117ab0.559±0.045ab0.524±0.166b0.696±0.070abF值7.57141.2745.24983.10611.0116.593P值0.023<0.010.048<0.010.010.031 注:与正常对照组相比,aP<0.05;与高渗对照组相比,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) circRNA:环状RNA Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with hypertonic control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) circRNA:circular RNA

2.3 部分差异表达circRNA的靶基因预测

根据结合位点个数以及紧密程度，表5列出每个差异表达circRNA的5个最可能相互作用靶miRNA。

表5 部分差异表达circRNA的靶miRNA预测Table 5 Target miRNA prediction of some differentially expressed circRNAs基因miRNA1miRNA2miRNA3miRNA4miRNA5hsa_circ_0002938hsa-miR-486-3phsa-miR-18a-5phsa-miR-18b-5phsa-miR-541-3phsa-miR-557hsa_circ_0008036hsa-miR-4778-3phsa-miR-4659b-3phsa-miR-6499-3phsa-miR-1227-3phsa-miR-4776-3phsa_circ_0001946hsa-miR-7-5phsa-miR-3529-5phsa-miR-8056hsa-miR-1246hsa-miR-139-3phsa_circ_0035277hsa-miR-224-5phsa-miR-616-3phsa-miR-520g-5phsa-miR-576-3phsa-miR-708-3phsa_circ_0008344hsa-miR-514a-5phsa-miR-433-3phsa-miR-148b-5phsa-miR-382-5phsa-miR-450b-3phsa_circ_0001874hsa-miR-661hsa-miR-662hsa-miR-593-5phsa-miR-107hsa-miR-103a-3p 注:circRNA:环状RNA;miRNA:微小RNA Note:circRNA:circular RNA;miRNA:micro RNA

3 讨论

Zhang等对比3名正常人和2例糖尿病患者的视网膜组织发现529个差异表达的circRNA，并证实has_circRNA_0005015分子可能与miR-519d-3p结合来调节血管内皮细胞功能。circRNA circHIPK3抑制miRNA-30a-3p表达，导致血管内皮生长因子C、Wnt2和卷曲受体4(frizzled class receptor 4，FZD4)表达增加，从而引起内皮细胞增生和血管功能障碍。在缺氧及高糖情况下，circRNA-ZNF609表达明显上调，可与内源性miR-615-5p结合，抑制miR-615-5p活性，增强HRVECs活力、迁移力及管腔成形能力。此外，在DR患者和非糖尿病患者的玻璃体标本及高糖培养的人脐静脉血管内皮细胞中，高通量测序筛选出差异表达的circRNA，证实circRNA通过靶向miRNA调节参与血管内皮功能和血管生成基因的表达。Liu等对周细胞中存在的circRNA-cPWWP2A进行研究，发现其可与miR579结合，改善糖尿病动物模型的视网膜渗漏情况。但是，本研究中未发现与这些针对DR研究相同的差异表达circRNA分子，其可能与标本来源存在差异有关。

本研究中对比分析了高糖和正常培养HRVECs的circRNA表达谱，发现448个差异表达circRNA。通过实时荧光定量PCR对其中表达变化显著的6个circRNA分子进行验证，其结果与芯片检测结果一致，表明芯片检测具有较高的可靠性，其中hsa_circ_0001946与本课题组前期对增生性DR患者血浆中差异表达circRNA分子相一致。

预测与hsa_circ_0001946有较强结合力的靶miRNA包括hsa-miR-7-5p、hsa-miR-3529-5p、hsa-miR-8056、hsa-miR-1246、hsa-miR-139-3p，其中hsa-miR-7-5p在高糖状态下与长链非编码小核仁RNA宿主基因16(ncRNA small nucleolar RNA host gene 16，SNHG16)结合，使SNHG16作为白细胞介素-1受体相关激酶1和胰岛素受体底物1竞争的内源性RNA，诱导视网膜微血管内皮细胞功能障碍，抑制内皮细胞增生；hsa-miR-1246在内皮组细胞衍生的外泌体中表达显著上调，可促进成纤维细胞向内皮细胞表型变化和血管生成。hsa-miR-1246还参与脂多糖诱导内皮细胞炎症反应和凋亡，hsa-miR-139-3p则可通过激活抑癌蛋白p53、p21和p16，参与宫颈癌的发生和发展。

miR-486-3p是hsa_circ_0002938预测的靶miRNA分子之一，已有报道显示，该分子表达上调时，可以抑制DR小鼠的氧化应激、炎症和凋亡过程，促进高糖状态下Müller细胞增生。miR-224-5p是hsa_circ_0035277预测的靶miRNA分子之一，有研究表明，该分子可能通过NLRP3通路参与2型糖尿病患者海马区炎症反应。由此可见，这些下游的部分miRNA可参与DR发病过程中的氧化应激、炎症等过程，影响内皮细胞增生、迁移和管腔形成能力以及血管内皮生长因子表达。在DR特征性的新生血管形成过程中，内皮细胞的激活和侵袭是其核心过程之一。因此，我们推测hsa_circ_0001946等差异表达circRNA可能通过与相应靶miRNA结合，导致视网膜内皮细胞功能障碍，进而影响DR的发生和发展，但需进一步的研究证实。

综上所述，本研究获得了高糖培养HRVECs的cricRNA差异表达谱，并验证了其中hsa_circ_0002938、hsa_circ_0008036、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0035277、hsa_circ_0008344和hsa_circ_0001874这6个表达变化最显著的circRNA分子，预测其可能的靶miRNA分子，这些circRNA可能通过miRNA参与DR的发生和发展。本研究为circRNA在DR中的机制研究提供了新的依据，但这些circRNA分子在DR过程中可能扮演的角色以及具体的作用机制仍有待进一步研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

志谢

感谢中国科技大学生命科学院、上海康成生物工程有限公司对本实验的帮助

作者贡献声明

贾杨雪：实验实施、数据整理及分析、论文撰写；王志玲、魏莹莹、朱恺：数据整理和分析；顾永昊：实验设计、论文修改及定稿