乳酸菌对苏尼特羊生长性能、屠宰性能、肉品质及蛋白质代谢的影响

2022-08-09王宏迪王柏辉王威皓关海天哈斯高娃

动物营养学报 2022年7期

王宏迪窦露王柏辉杨乐王威皓关海天段艳哈斯高娃靳烨*

(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010010；2.鄂尔多斯市检验检测中心，鄂尔多斯 017000；3.乌拉特中旗农牧和科技局，乌拉特中旗 015300)

羊肉含有丰富的优质蛋白质，是大众食用的主要肉类之一，其蛋白质含量与氨基酸组成是反映羊肉品质、风味及营养价值的重要指标。原始放牧条件下的苏尼特羊肉膻味轻，必需氨基酸含量高，胆固醇含量低，被誉为“肉中人参”。但随着国家退牧、限牧相关政策的实施，饲养模式的转变对羊肉品质产生了不利影响，因此如何改善舍饲羊肉品质成为研究热点。

乳酸菌不仅可以避免动物产生耐药性的潜在风险以及动物产品(如肉、蛋和奶)中抗生素的残留[1]，还能通过增加肠道有益菌数量和限制病原体的侵入来增强肠道健康，参与代谢，提高营养效率[2]。窦露等[3]和Vahedi等[4]研究发现，给畜禽饲喂乳酸菌后显著提高了肌肉抗氧化能力，并改善了肉品质和风味。魏莲清等[5]研究发现，发酵饲料可以提高白羽肉鸡的蛋白质代谢能力，促进蛋白质沉积。蛋白质作为维持动物骨骼肌正常生理功能的重要物质，直接影响着肉的风味、嫩度和色泽等肉品质指标。当体内营养物质充足时，蛋白质会进一步参与代谢循环，构成合成与分解的动态平衡，而这种动态平衡又是调节肌肉多少的关键过程，被严格的信号网络所调控[6]。研究发现，肠道菌群不仅维持着肠道功能，还很可能间接调控肌肉的代谢[7]。相关研究也证实饲粮补充益生菌可显著改善畜禽的肠道环境，如Yang等[8]给仔猪补充罗伊氏乳杆菌后，增加了菌株在远端小肠(空肠和回肠)的定殖，并且改善了盲肠内菌群结构，提高了机体抗氧化和免疫能力，有利于仔猪生长。而反刍动物独特的瘤胃消化系统是否能和单胃动物一样高效地利用乳酸菌，并且对蛋白质代谢产生影响，还需要进行深入探索。因此，本试验以3月龄苏尼特羊为研究对象，探究乳酸菌对其生长性能、屠宰性能、肉品质及蛋白质代谢的影响，以期为提升舍饲羊肉品质和改善生长发育提供新途径和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

乳酸菌为内蒙古某生物技术有限公司提供的复合微生态制剂，主要成分为植物乳杆菌HM-10、干酪乳杆菌HM-09及乳酸菌代谢产物，总活菌数为1.5×109CFU/g。

1.2 试验设计与饲养管理

在内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗川井苏木牧区选择14只健康无病、体重[(18.64±2.74) kg]接近的3月龄苏尼特羊，随机分为2组，每组7只。对照组饲喂基础饲粮，乳酸菌组在基础饲粮中添加2 g/只的乳酸菌。预试期7 d，正试期90 d。参考《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制基础饲粮，精粗比为6∶4，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items含量 Content石粉 Limestone1.00磷酸氢钙 CaHPO40.50食盐 NaCl0.75赖氨酸 Lys0.80预混料 Premix1)1.50合计 Total100.00营养水平 Nutrient levels2)代谢能 ME/(MJ/kg)11.57粗蛋白质 CP15.90中性洗涤纤维 NDF26.80酸性洗涤纤维 ADF17.60粗脂肪 EE5.60粗灰分 Ash7.80钙 Ca1.21总磷 TP0.63赖氨酸 Lys0.48

试验羊均在半封闭式羊舍内饲养，自由采食和饮水。为保证每只试验羊摄入相同剂量的乳酸菌，参考孙倩[9]的试验方法进行灌喂。在每天09:00左右称取14 g(2 g/只×7只)乳酸菌以70 mL水混匀，每只羊灌喂10 mL，此过程在饲养员协助下完成，其他饲养环境和管理条件均一致。

1.3 样品采集

屠宰前颈部静脉采血，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中暂存，用于血清生化指标测定。屠宰后取2 g左右股二头肌肉样于无菌无酶冻存管中并迅速投入液氮罐，用于蛋白质代谢相关基因表达的测定；取100 g左右股二头肌肉样于密封袋中并放入冰袋泡沫箱暂存，用于粗蛋白质、氨基酸含量等指标的测定。样品采集后，血样离心的上清液和肌肉组织样品置于-80 ℃冰箱保存，其他样品置于-20 ℃冰箱保存，待测。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能、屠宰性能

试验期间详细记录试验羊每日的采食时间、采食次数、采食量、初重和末重，计算生长性能指标。宰前断水2 h，禁食24 h，按照穆斯林阿訇屠宰方法进行宰杀，屠宰后根据现行国标《鲜、冻胴体羊肉》(GB/T 9961—2008)对羊胴体进行分割，测量并计算屠宰性能指标。

1.4.2 肉品质

屠宰后测定股二头肌的肉品质指标，主要包括pH45 min、pH24 h、红度(a*)值、亮度(L*)值、黄度(b*)值、剪切力和蒸煮损失，具体操作步骤及计算公式参照杜瑞[10]。

1.4.3 血清生化指标

采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，测定血清葡萄糖(glucose，GLU)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLB)、尿素氮(urea nitrogen，UN)含量及谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性。

1.4.4 肌肉蛋白质含量

根据现行国标《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2016)[11]测定股二头肌中蛋白质含量。

1.4.5 肌肉氨基酸含量

使用高速氨基酸分析仪(LA-8080，日本Hitachi公司)，根据现行国标《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124—2016)[12]测定股二头肌中氨基酸组成和含量。

1.4.6 蛋白质代谢相关基因表达

称取约100 mg的股二头肌肉样，参考王柏辉[13]的试验方法，用RNAiso Plus试剂盒提取总RNA，并用微量分光光度计测定吸光度值及RNA浓度；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性；再将总RNA稀释至500 ng/μL，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录，反转录获得浓度为50 ng/uL的cDNA，于-20 ℃保存；在NCBI网站查找蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p70核糖体蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K1)、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translational initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1)、肌肉萎缩相关基因-1(atrophy gene-1，Atrogin-1)、肌肉特异性环指蛋白1(muscle ring-finger protein 1，MuRF1)、叉头转录因子1(forkhead box 1，FoxO1)和叉头转录因子3(forkhead box 3，FoxO3)的mRNA信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物序列(表2)；以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，根据TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明配制反应体系，使用LightCycler®96实时荧光定量PCR仪[罗氏诊断产品(上海)有限公司]进行实时荧光定量PCR，采用2-△△Ct法计算相关基因的mRNA相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR引物

续表2基因Genes引物序列Primer sequences (5′—3′)大小Size/bp登录号Accession No.退火温度Tm/℃肌肉特异性环指蛋白1MuRF1F:AATGCCTTGTTCTCTGGTTCGCTAGR:ACTCTGGCTGTCCTGGGAATGTAG168XM_004005100.558叉头转录因子1FoxO1F:TGTCCTACGCCGACCTCATCACR:GCACGCTCTTGACCATCCACTC192XM_027973596.257叉头转录因子3FoxO3F:AGCCAAACACCAGCAACAGTCTCR:TTGAGTACAAGGAGGAGCCTGAGAG166XM_042253148.157

1.5 数据分析

数据经Excel 2019初步处理后，利用SPSS 23.0进行t检验，各组数据以平均值±标准差表示，P<0.05代表差异显著。蛋白质代谢相关基因相对表达量数据使用Origin 2019作图。

2 结果

2.1 乳酸菌对苏尼特羊生长性能的影响

由表3可知，乳酸菌组的平均日增重显著高于对照组(P<0.05)，2组之间末重、平均日采食量和料重比无显著差异(P>0.05)。

表3 乳酸菌对苏尼特羊生长性能的影响

2.2 乳酸菌对苏尼特羊屠宰性能的影响

由表4可知，乳酸菌组的胴体重、眼肌面积和屠宰率显著高于对照组(P<0.05)，2组之间其他屠宰性能指标无显著差异(P>0.05)。

表4 乳酸菌对苏尼特羊屠宰性能的影响

2.3 乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响

由表5可知，乳酸菌组的股二头肌pH24 h和b*值显著高于对照组(P<0.05)，股二头肌蒸煮损失和剪切力显著低于对照组(P<0.05)，2组之间股二头肌pH45 min、L*值和a*值无显著差异(P>0.05)。

表5 乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响

2.4 乳酸菌对苏尼特羊蛋白质代谢的影响

2.4.1 乳酸菌对苏尼特羊血清生化指标的影响

由表6可知，乳酸菌组的血清白蛋白、总蛋白含量和谷丙转氨酶、碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，血清尿素氮含量显著低于对照组(P<0.05)，2组之间血清葡萄糖、球蛋白含量和谷草转氨酶活性无显著差异(P>0.05)。

表6 乳酸菌对苏尼特羊血清生化指标的影响

2.4.2 乳酸菌对苏尼特羊肌肉蛋白质含量和氨基酸组成的影响

由表7可知，乳酸菌组的股二头肌蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05)。在苏尼特羊股二头肌中共检测出17种氨基酸，包括7种必需氨基酸和10种非必需氨基酸。乳酸菌组的股二头肌苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、必需氨基酸、鲜味氨基酸和总氨基酸含量显著高于对照组(P<0.05)。

2.4.3 乳酸菌对苏尼特羊肌肉蛋白质代谢相关基因表达的影响

由图1可知，饲喂乳酸菌后上调了苏尼特羊股二头肌中蛋白质合成相关基因的mRNA相对表达量，其中，乳酸菌组的股二头肌Akt1、mTOR、p70S6K1的mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。

由图2可知，饲喂乳酸菌后下调了苏尼特羊股二头肌中蛋白质分解相关基因的mRNA相对表达量，其中，乳酸菌组的股二头肌Atrogin-1、MuRF1的mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨论

3.1 乳酸菌对苏尼特羊生长性能的影响

乳酸菌不仅可以调节反刍动物胃肠道菌群结构，还能作为免疫调节剂刺激反刍动物局部或全身防御系统，提高动物健康水平，促进生长。研究表明，乳酸菌在胃肠道中可促进消化酶、有机酸和维生素等多种活性物质分泌，帮助动物对不同食物的消化和吸收；还会降低肠道pH，改善肠道微生物群落结构，有助于反刍动物分解高纤维饲料，提高饲料的消化吸收率[14]，从而提高生长性能。Casper等[15]和王珍珊等[16]研究表明，在饲粮中补充乳酸菌后显著提高了反刍动物的平均日增重和饲料转化率，改善了其肠道健康和生长性能。栾嘉明等[17]研究表明，乳酸菌能够转变肉羊瘤胃发酵方式，维持胃肠道菌群平衡，在增加动物采食量的同时，提高饲料利用率和营养汲取率，提高机体免疫能力，从而达到提高生长性能的目的。本研究中，饲粮添加乳酸菌提高了苏尼特羊的平均日增重，降低了料重比，说明乳酸菌能促进苏尼特羊对营养物质的利用。同时，本团队前期研究发现，乳酸菌进入羊的胃肠道后，增加了有益菌的定植，并提高了小肠绒毛高度[10]。因此，饲粮添加乳酸菌有利于机体汲取营养物质，从而对苏尼特羊生长发育起到促进作用。

表7 乳酸菌对苏尼特羊肌肉蛋白质含量和氨基酸组成的影响

3.2 乳酸菌对苏尼特羊屠宰性能的影响

屠宰性能是反映生产性能的重要指标，动物的日常饲养管理水平、日龄、环境和添加剂等可直接影响畜禽的屠宰性能。白艳苹[18]研究发现，饲粮添加乳酸菌能够提高肉羊的眼肌面积，且眼肌面积的大小与胴体品质的优劣呈正相关。占今舜等[19]研究发现，添加益生菌后山羊的宰前活重、眼肌面积、胴体重和屠宰率均有所提高。本研究表明，饲粮添加乳酸菌后显著提高了苏尼特羊胴体重、眼肌面积和屠宰率。结合前人研究结果，说明在饲粮中添加乳酸菌可对苏尼特羊的屠宰性能有一定的促进作用。而Kim等[20]在饲粮中补充乳酸菌后发现，肉牛的胴体重、屠宰率和眼肌面积等指标并没有发生显著变化，但对其具有一定的促进作用。这种不一致性可能是试验动物种类和乳酸菌活性成分组成不同造成的，不同种类的动物对饲料的利用率不同，从而表现出生长性能的差异。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

图2 乳酸菌对苏尼特羊股二头肌中蛋白质分解

3.3 乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响

肉品质是评价肉质特性的综合指标，主要包括pH、色泽(a*值、L*值和b*值)、蒸煮损失和剪切力等。pH可反映宰后肌肉糖酵解的进程，与肉的色泽、嫩度和持水能力等密切相关[21]。正常宰后肌肉pH45 min在6.0～7.0，pH24 h为5.7左右。本试验中，苏尼特羊股二头肌的pH45 min和pH24 h均在正常范围内，且乳酸菌组的pH24 h显著高于对照组，这可能是由于饲粮添加乳酸菌提高了股二头肌中的抗氧化酶活性，减弱了肌肉细胞的无氧酵解，使得乳酸产生量减少，最终使得pH24 h升高[22]。肉色是消费者判断肉品新鲜度的主要指标。杜瑞等[23]报道，饲粮添加乳酸菌后羊背最长肌的a*值升高，b*值降低，肉色有所改善。本研究中，饲粮添加乳酸菌后导致股二头肌的b*值升高，这与先前的研究相悖，出现这种差异可能与肌肉部位不同有关[24]。相关文献报道不同类型肌纤维其肉品质特性存在较大差异[25]；本团队前期研究结果表明，苏尼特羊股二头肌是典型的氧化性肌纤维，而背最长肌是酵解型肌纤维[18]，同时股二头肌的运动量较背最长肌大，因此二者的品质特性存在较大差异。此外，本试验采用的是人为灌喂的方式使苏尼特羊摄食乳酸菌，而非在其主观下进行的，这会使羊受到不同程度的应激，从而会影响肉品质的多项评定指标。乳酸菌组的蒸煮损失显著低于对照组，说明饲粮添加乳酸菌提高了苏尼特羊肉的持水力，这与王磊等[26]的研究结果一致。剪切力是衡量肉类嫩度的重要指标，剪切力越小肉质越嫩。本试验中，乳酸菌组剪切力值显著低于对照组，说明饲粮添加乳酸菌能够改善苏尼特羊肉嫩度，而肌肉肌束膜中脂肪含量与嫩度密切相关。Dowarah等[27]研究发现，乳酸菌会加快畜禽的脂质代谢速率，增加肌肉肌束膜中脂肪含量，进而改善了肌肉的嫩度。

3.4 乳酸菌对苏尼特羊蛋白质代谢的影响

饲粮中的营养成分被机体消化和吸收后，通过血液循环输送给各个组织和器官，进而对机体产生影响。血清中葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白和尿素氮等指标可以反映机体蛋白质代谢情况和营养物质消化吸收的效率。葡萄糖是机体的能量载体，其正常含量应低于6.10 mmol/L[28]。本研究中，2组苏尼特羊的血清葡萄糖含量均在正常范围内，且2组之间无显著差异，说明苏尼特羊的能量代谢处于正常水平。血清总蛋白含量可以反映畜禽体内的蛋白质代谢水平，白蛋白主要作用于体内代谢物质转运、维系血浆渗透压稳态以及营养吸收等方面[29]。而由蛋白质分解代谢产生的尿素氮，其含量能够负面反映出机体对蛋白质吸收和利用的程度[30]。本试验中，饲粮添加乳酸菌提高了苏尼特羊血清总蛋白和白蛋白含量，降低了血清尿素氮含量，这与何韵秋等[31]和杨华等[32]的研究结果相似，说明乳酸菌可以加快苏尼特羊体内的代谢物质转运，提高蛋白质代谢速率。谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶在机体蛋白质代谢中发挥重要作用，能够催化多种反应合成氨基酸，为蛋白质合成提供充足底物。殷溪莎[33]给犊牛饲喂不同水平乳酸菌后发现，犊牛血清中碱性磷酸酶活性与乳酸菌含量成正比，同时谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性与平均日增重、平均日采食量等有显著相关性。本研究中，饲喂乳酸菌后苏尼特羊血清中谷丙转氨酶和碱性磷酸酶活性显著提高，说明饲粮添加乳酸菌可以提高氨基酸利用率，改善机体血液蛋白质代谢水平，进而促进苏尼特羊生长。

蛋白质含量的增加可以提高畜禽产肉率和肉的营养价值等性能[34]。本研究中，乳酸菌组的股二头肌蛋白质含量显著高于对照组，这可能是由于乳酸菌进入体内会激活胃蛋白酶等消化酶，并在代谢过程产生维生素和有机酸等活性物质，促进了反刍动物对高纤维饮食的消化和营养物质的吸收，从而促进蛋白质合成[35]。氨基酸是蛋白质合成的分子基础，其组成和含量不仅影响肉类的营养价值和风味特性，还会作为信号分子影响蛋白质代谢循环[36]。苏尼特羊股二头肌中共检测出17种氨基酸，其中乳酸菌组的股二头肌苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘氨酸含量显著高于对照组。氨基酸与肉的风味密切相关，它不仅是滋味物质的重要前体物质，还能与不同种类的风味物质进行物理或化学吸附，从而改变肉品风味[37]。本研究结果显示，饲粮添加乳酸菌显著增加了鲜味氨基酸含量，说明乳酸菌能够通过改善氨基酸组成增加肉质风味，使肉质鲜美。窦露等[3]在饲粮中添加乳酸菌后发现，乳酸菌能够丰富羊肉的风味物质种类和相对含量，羊肉风味更浓郁。整体上，乳酸菌组的必需氨基酸、鲜味氨基酸和总氨基酸含量高于对照组，这表明乳酸菌的添加有利于提高羊肉的风味和营养价值。

Akt是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它既可以通过mTOR促进肌肉蛋白质的合成，又可以通过调节叉头转录因子(FoxO)家族影响肌肉蛋白质降解[38]。mTOR是生长因子和氨基酸等营养信号的关键整合器，在调节蛋白质代谢和调控细胞生长、增殖等方面发挥重要作用，主要通过其下游信号通路中的4E-BP1和p70S6K1诱导蛋白质合成。氨基酸不仅是蛋白质的前体物质，还是mTOR信号通路的敏感因子，研究表明，亮氨酸缺乏对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)具有抑制作用，当亮氨酸存在时，其传感器接收信号并激活mTORC1，进而促进翻译起始和延伸阶段，加速蛋白质合成[39]。也有研究表明，精氨酸可通过上调mTOR通路中mTOR、4E-BP1和p70S6K1的mRNA表达量，增加肠上皮细胞蛋白质的合成，降低蛋白质的分解[40]。本研究结果显示，与对照组相比，乳酸菌组Akt、mTOR、p70S6K1的mRNA相对表达量显著提高；同时，乳酸菌组亮氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸含量显著高于对照组，所以饲粮添加乳酸菌后可能会通过增加氨基酸含量，进而激活mTOR信号通路及其下游信号分子p70S6K1和4E-BP1的磷酸化，达到促进蛋白质合成的作用，具体作用机制还有待于进一步研究。

真核生物40%～50%的蛋白质都是由泛素蛋白质酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)途径降解[41]。研究表明，泛素与蛋白质结合过程中会由特定的连接酶Atrogin-1和MuRF1介导，其发生速率是UPP的限速步骤[42]，当Akt磷酸化受到抑制时会导致FoxO去磷酸化，而FoxO1和FoxO3可以上调Atrogin-1和MuRF1的表达来促进肌肉萎缩，进而影响肌肉蛋白质的分解。本试验结果表明，饲粮添加乳酸菌显著下调了苏尼特羊股二头肌中MuRF1和Atrogin-1的mRNA相对表达量。Bindels等[43]给小鼠口服乳酸菌后发现，乳酸菌显著下调了小鼠肌肉组织中MuRF1和Atrogin-1的mRNA相对表达量，降低了蛋白质分解代谢。

综上所述，饲粮添加乳酸菌会对蛋白质合成代谢产生积极影响，促进肉中蛋白质沉积，改善氨基酸含量与组成。