朗德鹅TLR4基因的生物信息学分析
2022-08-09王权锜张会新刘玉芬
王权锜，张会新，程 敏，刘玉芬
（哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150025）
Toll样受体（TLRs）属于一种模式识别受体（PRPs），在动物免疫应答反应中起重要作用，其通过识别病原相关分子模式（PAMPs）来启动天然免疫应答，达到清除病原微生物及相关代谢产物的目的。目前已经在禽类中发现10种TLRs（TLR1La/b、TLR2a/b、TLR3/4/5/7/15/21），其中TLR3/4/5/7与哺乳动物中发现的TLRs是直系同源物[1-2]。而TLR4作为唯一一种介导MyD88和TRIF两种信号通路的TLRs家族成员，可以引发一系列级联反应导致TNFα、IL-6、IL-8和IL-12等细胞因子的释放[3-4]。Wang等[5]首次克隆出朗德鹅TLR4基因，全长2641 bp，预测编码843个氨基酸，并检测出在过度喂养条件下，TLR4在皮下脂肪和肠中的表达显著增加，但在心脏中表达下降。朱道仙等[6]研究证实患痛风病的雏鹅肠道内菌群发生变化可激活TLR4/MyD88/NF-κB通路，进而诱导炎症反应使肾脏受损。上述研究提示TLR4在鹅免疫系统中发挥着重要作用。本研究通过生物信息学的方法分析鹅TLR4蛋白特征，为进一步探索TLR4基因在鹅免疫系统中的功能提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从NCBI中检索不同物种TLR4基因编码蛋白质序列，朗德鹅（AEC32857.1）、马岗鹅（AKF02412.1）、绿头鸭（NP_001297342.1）、芦花鸡（AFK08533.1）、灰山鹑（AGO86772.1）、黑尾原鸡（ACR26280.1）、非洲鸵鸟（AKP92940.1）、斑胸草雀（ACN58233.1）、密河鳄（KYO23184.1）、虎斑响尾蛇（XP_039178821.1）、斑马鱼（XP_009292463.1）、鲤鱼（XP_018980331.2）。
1.2 试验方法
通过生物信息学软件对朗德鹅TLR4基因编码产物理化性质、结构、功能以及进化性进行分析（表1）。
表1 生物信息学软件及网址
2 结果
2.1 鹅TLR4基本特征
通过ExPASy-ProtParam、ExPASy-ProtScale以及UniProt数据库对朗德鹅TLR4基本理化性质、亲/疏水性以及亚细胞定位进行预测，结果显示TLR4基因共编码843个氨基酸残基，分子式为C4364H6867N1135O1239S32，理论等电点7.55，亲水系数0.019（＞0）。疏水性最强残基为亮氨酸（3.611），亲水性最强氨基酸残基为组氨酸（-3.311），疏水性氨基酸残基相对较多（图1）。UniProt数据库预测可以看出鹅TLR4大部分定位于细胞膜（图2）。
图1 鹅TLR4亲/疏水性预测
图2 鹅TLR4亚细胞定位
2.2 鹅TLR4基础结构预测
通过SignalP-5.0、TMHMM-2.0以及SMART对朗德鹅TLR4进行信号肽、跨膜结构域以及结构域预测，结果显示鹅TLR4具有信号肽的可能性为0.8497，剪切位点位于第28和29位残基之间（图3），与SMART预测结果相似。TMHMM-2.0预测出2个跨膜结构域（图4），第一个跨膜结构域位于第12至第34位残基之间；第二个跨膜结构域位于第640至662位残基之间。SMART预测结果显示，TLR4胞外区具有8个亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat,LRR）、1个C端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat C-terminal damain,LRR_CT）以及胞内区的TIR结构域（图5）。
图3 鹅TLR4信号肽预测
图4 鹅TLR4跨膜预测
图5 鹅TLR4结构域预测
2.3 不同物种间TLR4氨基酸序列的进化性
通过MEGA7分析在NCBI中检索的不同物种TLR4氨基酸序列的进化性。结果显示，朗德鹅与马岗鹅、绿头鸭、芦花鸡、灰山鹑、黑尾原鸡亲缘关系最近，与非洲鸵鸟、斑胸草雀的亲缘关系较近，而与爬行类和鱼类的亲缘关系较远（图6）。
图6 朗德鹅TLR4氨基酸序列进化树
2.4 鹅TLR4修饰位点预测
通过NetNGlyc-1.0和NetPhos-3.1预测鹅TLR4修饰位点。其中N-糖基化位点存在12个，但位于第626和640位残基的修饰可信度得分较低，分别是0.3883和0.3824（图7）。磷酸化位点预测显示鹅TLR4存在89个磷酸化位点，其中丝氨酸（S）61个、苏氨酸（T）22个、酪氨酸（Y）6个。
图7 鹅TLR4 N-糖基化位点
2.5 鹅TLR4高级结构预测
通过SOPMA和I-TASSER预测鹅TLR4二级、三级结构，结果显示鹅TLR4蛋白由α-螺旋（54.69%）、延展链（12.34%）、β-转角（2.58%）以及无规则卷曲（30.13%）四种结构组成（图8）。三级结构预测结果可以看出，胞外区是TLR家族典型马蹄形结构，纯黑色部分为亮氨酸（Leu），大部分位于胞外区，与SMART预测的LRR结构域存在于胞外区结果相吻合，结合二级结构预测可判断跨膜方式属于α-螺旋跨膜（图9）。
图8 鹅TLR4二级结构
图9 鹅TLR4三级结构
2.6 鹅TLR4相互作用预测
通过STRING数据库预测与鹅TLR4相互作用的蛋白质，并构建相互作用网络图（图10）。结果显示鹅TLR4与TIRAP、LY96、MYD88、HMGB1以及TRAF6等10种蛋白质有相互作用，相关评分见表2。
表2 TLR4与10种蛋白质相关度评分
图10 鹅TLR4相互作用预测
3 讨论与结论
在朗德鹅TLR4蛋白基本理化性质分析中可以看出在600～700位残基之间存在疏水峰值，推测该位置可能为疏水的跨膜结构域，之后的跨膜结构域以及结构域预测则证实了上述猜测，这也与猪、牛等哺乳动物跨膜结构域预测相吻合[7-8]。在TMHMM-2.0预测出来的两个跨膜结构域中，第一个跨膜结构域与SignalP-5.0预测的信号肽区域重合，可以判断该位置并没有跨膜结构域，这符合SMART的预测结构。
TLR4胞外区具有保守性的结构域LRR，但在三花鹅TLR4胞外区前321位残基中有6个LRR[9]，而朗德鹅相同位置的LRR的数量只有4个，可能是因为106位和205位残基发生错义突变所导致，而在哺乳动物海南地方猪中已经证实G7209T或G7781A位点的突变可导致TLR4蛋白质分子结构发生改变，并可能影响LRR的数量[10]。可以看出TLR4基因序列具有多态性，具体功能是否受到影响还有待进一步探究。但以往研究已经证明在鸭中免疫机能会受到TLR4第3外显子中基因多样性的影响[11]。
TLR4氨基酸序列进化性分析显示，TLR4在不同物种间存在一定差异性，与三黄鸡TLR4进化性分析相符[12]。其中朗德鹅与马岗鹅亲缘关系最近，而与同为禽类的非洲鸵鸟、斑胸草雀亲缘关系较远，可能是因地缘关系所导致，在鱼类中与斑马鱼亲缘关系较远，这可能是斑马鱼和禽类的TLR4相比不仅缺失了识别LPS的能力，同时也缺少了信号肽区[13-14]。String蛋白互作预测结果显示，TIRAP、LY96、MYD88评分达到了0.999，LY96是协同TLR4识别其激动剂LPS的重要蛋白[15]，TIRAP是含TIR域的接受子蛋白，其与MYD88、TRIF、TRAM等在TIR下游信号传导中起着重要作用，MYD88是一种胞质衔接蛋白，在实验中是衡量TLR4表达量的重要参照。
通过生物信息学分析朗德鹅TLR4蛋白基本特性、修饰位点、进化性以及高级结构特征等，结构符合TLRs家族典型特征，修饰位点多处于胞外功能区，进化性分析说明不同种生物间TLR4存在着种属差异性。本分析为研究TLR4的免疫功能以及鹅养殖中抗病育种提供了理论基础。
