试管凝集试验与微量凝集试验检测奶牛布鲁氏菌病效果比较

高军军，宋建国，车小蛟，孟林明，韩庆彦

（甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730030）

布鲁氏菌病是一种人畜共患传染病，多发于牛羊[1]。牛羊布病主要以母畜流产、死胎和公畜睾丸肿大发炎为主要特征；人布病临床症状主要表现为乏力、睾丸炎、流产、慢性关节病变等，严重影响劳动能力[2]。为了探究试管凝集试验与微量凝集试验检测奶牛布鲁氏菌病的效果，开展本试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 布鲁氏菌病试管凝集抗原批号010042003，每瓶10 ml，阳性对照批号010061901，阴性对照批号010051904，购自青岛立见生物科技有限公司；布鲁氏菌病试管凝集抗原批号20191030，每瓶15 ml，阳性对照批号201702，每瓶1 ml，阴性对照批号201501，每瓶1 ml，中国兽医药品监察所提供。0.5%石碳酸由甘肃省动物疫病预防控制中心实验室配制。

1.1.2样品来源 将保存的未免疫布病疫苗（A19）的奶牛血清146份样品，通过虎红平板凝集试验筛选出15份凝集血清，将15份血清样品和6份已知盲样用布病凝集试验的常量法和微量凝集试验进行复核比较。

1.1.3实验器材 电热恒温培养箱（德国迈德赛有限公司）；单、多道已经校正过的移液枪（10～100 μl、100～1000 μl单道移液枪等，德国艾本德股份公司）；灭菌枪尖、96孔U型微量板、试管架、凝集玻璃试管（可用未添加抗凝剂的5 ml或3 ml真空采血管替代）、一次性96孔封口膜、湿盒、振荡器、分析天平、恒温培养箱、校准过的温度计等。

1.2 试验方法

1.2.1试管凝集试验（SAT）抗原及阴阳性对照在使用前室温放置20～40 min。每份血清需要4支凝集玻璃试管，依次编号1～4，第1支试管加入960 μl稀释液，第2～4管各加入500 μl稀释液[3]，将40 μl虎红抗体阳性奶牛血清（包括阴阳性对照）加入第1管，按1～4管顺序（量程调到500 μl）倍比稀释到第4管，第4管弃去500 μl，振荡器混匀，第1～4管的血清滴度变为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200，然后在1～4管中加入500 μl抗原（1∶20稀释），则第1～4管血清滴度变为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，比浊管（抗原1∶40稀释）的配制同时进行，缓慢放入37 ℃电热恒温培养箱孵育22 h，取出观看结果[3]。

“++++”表示菌体100%凝集，“++”是比较难观察的，和各加了0.5 ml稀释液和抗原（抗原1∶40稀释）的比浊管透亮度一样，但管底的沉淀有差别，主要看清亮度，清亮度与相对应比例的比浊管比较，下层凝集物程度也可以作为参照。判定标准注重人为差异，防止摇动，在自然光下按要求观察上清，再结合管底层凝集程度判定结果。奶牛血清滴度在1∶100出现两个“++”及以上，就判为阳性，奶牛血清滴度在1∶50出现两个“++”及以上，判为可疑。

1.2.2微量凝集试验（MSAT）抗原及阴阳性对照恢复室温20～40 min，在96孔U型微量板上操作，每份奶牛血清需要4个连续孔，第1孔中加入192 μl稀释液，第2～4孔中加入100 μl稀释液，将8 μl虎红抗体阳性奶牛血清（包括阴阳性对照）加入第1孔中（血清25倍稀释），用12道排枪（量程调到100 μl）从第1～4孔进行倍比稀释，第4孔弃去100 μl，第1～4孔的样品稀释比例变为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。将100 μl抗原（1∶20稀释）加入每个稀释过的孔中，第1～4孔奶牛的血清稀释比例翻倍，变为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。先用封口膜粘住，振荡器上混匀2～3 min，放湿盒内置37 ℃恒温培养箱孵育22 h，取出观看结果并做好原始记录[3]。

“++++”表示孔底凝集物呈片状凝集于孔底（100%凝集），“+++”表示孔底凝集物基本呈片状凝集，开始出现极少量白色点状凝集（75%凝集），“++”表示出现明显的白色点状凝集（50%凝集），“-”表示孔底全是白色点状凝集（没有凝集）。结果判断时须同时观察60°倾斜时白色点状流动情况，如“++”会出现明显的白色点状凝集，且60°倾斜时白色点状凝集大部分流动。奶牛血清样品第2孔（滴度1∶100）出现两个“++”，就判为阳性，滴度越高孔底凝集越彻底，阳性就越强；在样品第2孔（滴度1∶100）出现一个“+”或第1孔（滴度1∶50）出现“++”及以上，判为可疑，需要四周后重复采集之前奶牛样品，如果仍为可疑判阳性[4]。

2 结果与分析

试管凝集试验（SAT）与微量凝集试验（MSAT）结果见表1。在完全一样的条件下（试剂、耗材、试验条件、人员），SAT和MSAT阴阳性对照成立，抗原没有发生自凝，试验成立。15份奶牛样品中，试管凝集抗体阳性10份，阴性5份；微量凝集抗体阳性10份，可疑2份，阴性3份。用青岛立见生物科技有限公司的抗原做了多次重复试验，试验结果一致；换中国兽医药品监察所的抗原，试验结果一致。奶牛场将这两头可疑的奶牛进行隔离饲养，一个月后重新采样检测，用MSAT和SAT两种方法和两种试剂进行比对试验，试验结果完全一致，一份奶牛转为阳性，一份变为阴性，之后对该奶牛场进行了全群布病监测及净化。6份已知盲样用凝集试验中的微量凝集试验和常量法进行方法比对，试验结果见表2。两种试验盲样比对结果一致，用两种试剂分别对两种试验方法进行比对，结果也完全一致，两种试验重复性好，MSAT结果准确。

表2 6份布病已知盲样试管凝集试验和微量凝集试验结果对比

3 讨论

用两种有资质厂家的试剂进行多次重复试验，结果一致，重复性良好，SAT和MSAT两种试验一般用于布病虎红平板抗体阳性确诊，不适合初筛[5]。对试管凝集阴性但有滴度的样品及可疑样品要高度重视，四周后持续采样进行监测，防止漏检误检，一旦发现布病抗体阳性且有临床症状的奶牛，需要每年对全群进行2～3次净化监测，直至连续两次全群布病检测都为抗体阴性[6]。试管凝集试验检测过程比较繁琐，费时费力，结果判定受人为因素影响较大，而微量凝集试验操作过程更简便精确，节约试剂耗材，试验结果更容易准确判断，稳定性和特异性也较高。

基层一般用虎红平板凝集试验进行初筛，用试管凝集试验、微量凝集试验和常量法及荧光PCR进行确诊，由于布鲁氏菌病实时荧光PCR检测费用高，人员要求和实验室设备要求也比较高[7]，基层实验室很少用这种方法。MSAT被纳入GB/T 18646—2018其中，经过多次重复试验结果可靠，MSAT特异性与SAT基本无差别，相比试管凝集试验有一定的优势（无论是操作过程或费用），建议基层兽医实验室推广应用。