溴苯基姜黄素对胆管癌细胞裸鼠移植瘤抑制作用及机制

赵冀安 张梅 张蕊 董梁 聂文佳 刘文聪 刘维丽

(河北医科大学第一医院 1普通外科，河北 石家庄 050013；2感染性疾病科；3消化内科；4医务处；5超声科；6肝胆外科)

胆管癌恶性程度高、发病隐匿、诊治困难，所以发病率和死亡率呈上升趋势。外科根治性切除为胆管癌治疗首选，其对放化疗均不敏感，所以预后较差，远期治疗效果欠佳〔1〕。寻找有效抑制胆管癌细胞增殖侵袭的方法，是目前困扰临床医生的主要问题。姜黄素(CUR)是姜黄的有效成分，在临床实验中对肝癌、结肠癌、乳腺癌等癌症有很强的抗肿瘤作用〔2〕。但是临床研究显示由于其生理条件下的不稳定性，使其出现了较差的生物活性和药代动力学特征，从而限制了它在抗癌治疗方面的应用〔3,4〕。溴苯基CUR(GL63)是CUR的一种衍生物，具有明显的水溶性和稳定性，且具有较高的细胞通透性、生物利用度和抗肿瘤活性〔5〕。Wang等〔6〕表明与CUR相比，GL63能更有效地抑制信号转导和转录活化因子(STAT)3磷酸化，下调STAT3下游靶点阵列，从而抑制细胞增殖、集落形成、细胞迁移和侵袭及诱导细胞凋亡。本研究选用人胆管癌RBE细胞和BALB/C-nu雌性裸鼠制造移植瘤动物模型，研究GL63对细胞和移植瘤的抑制作用，并研究其机制。

1 材料与方法

1.1材料 GL63由河北科技大学刘守信教授合成并提供。人胆管癌RBE细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。BALB/C-nu雌性裸鼠，6周龄，体重16～18 g，购于河北医科大学动物中心，并在SPF级环境中饲养。RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司，磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)2、磷酸化(p)-STAT3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-2和β-actin兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2RBE细胞的培养 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基对人胆管癌RBE进行培养，置于含5% CO2的37℃的培养箱中。当培养瓶底部贴壁细胞达90%以上时，用0.25%胰酶消化传代并进行实验。为了进行细胞集落分析，将1 000个细胞/孔分3次接种在6孔板中，并在37℃和5% CO2的加湿室内培养2 w。RBE细胞集落用1%结晶紫染色计数。

1.3噻唑蓝(MTT)比色法检测RBE细胞增殖抑制率 将对数生长期的RBE细胞培养12 h，弃去培养基，各组分别加入含1%二甲基亚矾的不同浓度GL63(0、10、20 μmol/L)。分别培养8 h、12 h和24 h后，每孔加入20 μl的5 mg/ml MTT溶液，继续培养4 h，吸取上清液后，每孔加入150 μl二甲基亚砜，低速摇床震荡10 min后用酶联免疫吸附试验仪检测570 nm每孔的吸光度(OD)值。抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期情况 对数生长期RBE细胞以1×105/孔接种于6孔板中，培养24 h后，弃培养液，加入不同浓度的GL63处理(0、10、20 μmol/L)。继续培养24 h后收集、洗涤细胞，先加膜联蛋白V异硫氰酸荧光素(Annexin V)5 μl，再加丙酸碘10 μl混匀，避光反应20 min后，用流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期。

1.5移植瘤模型建立和分组 收集乙二胺四乙酸(EDTA)消化的对数生长期人胆管癌RBE细胞，将其配制成浓度为1×107个/ml的单细胞悬液，接种到裸鼠背部皮下，接种后观察。待裸鼠皮下肿瘤直径增至5～6 mm时认为成瘤，按照每组10只随机分对照组和低、高浓度GL63组，各组裸鼠瘤体大小差异无统计学意义。低、高浓度GL63组裸鼠腹腔分别注射10、20 μmol/L GL63溶液0.2 ml，对照组注射等量无菌生理盐水。给药3次/w，共4 w。用药后每隔4 d测量肿瘤体积，肿瘤体积=1/2长径×短径2，4 w后处死各组裸鼠，完整剥取肿瘤，对裸鼠身体重量和肿瘤重量进行测量，抑瘤率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100%。

1.6病理组织学检测 10%甲醛固定肿瘤组织，制备成4 μm厚度连续石蜡切片，常规二甲苯脱蜡、水化、抗原微波修复，山羊血清封闭，滴加细胞增殖抗原(PCNA，1∶100)4℃冰箱过夜。滴加链霉素蛋白-过氧化氢酶溶液标记二抗，孵育后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，二氨基联基胶(DAB)显色。每次染色设同步阳性和阴性对照。光镜下观察、摄片，随机选取5个视野，观察阳性细胞。PCNA蛋白表达定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色。无着色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。阳性细胞占计数细胞比例：染色比例小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，大于50%为3分。2项相加为最后判断结果：两者分数之和最大值为6，0～2分阴性表达，>2分为阳性表达。

1.7Western印迹 切取肿瘤组织碾碎低温超声匀浆，加入蛋白质提取液裂解，高速离心后收集上清液，电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再用5%脱脂牛奶封闭，随后加入1∶1 000的兔抗人p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和β-actin多克隆抗体4℃过夜。而后用TBST清洗后再分别加入1∶5 000标记的山羊抗兔抗体，室温孵育后经电化学发光(ECL)检测，用图像分析软件进行分析。

1.8统计学处理 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组不同时间点RBE细胞增殖抑制率比较 RBE细胞的增殖和克隆形成随GL63浓度增加而下降。RBE细胞形态和增殖率在显微镜下观察发现，不同浓度GL63在不同时间点作用于RBE细胞，抑制率逐渐升高，细胞增殖率逐渐降低。表明GL63可显著抑制RBE细胞增殖，其增殖抑制率呈浓度和时间依赖关系(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组培养不同时间点抑制率比较

图1 各组RBE细胞集落形成

2.2各组RBE细胞凋亡率和细胞周期比较 与对照组〔(1.32±0.30)%〕相比，低、高浓度GL63组凋亡率〔(28.42±4.40)%、(64.55±6.60)%〕显著升高，且呈浓度依赖性(均P<0.05)，高浓度GL63组细胞凋亡诱导作用最为明显；G0/G1期细胞比例随GL63浓度增加而升高。对照组G0/G1期细胞比例〔(34.58±1.09)%〕、明显低于低、高浓度GL63组〔(51.26±0.45)%、(68.69±0.85)%；均P<0.05〕。表明GL63阻滞细胞周期于G0/G1期，促使细胞发生凋亡，见图2、图3。

图2 流式细胞学检测各组RBE细胞凋亡率

图3 流式细胞学检测各组RBE细胞周期

2.3各组裸鼠体重、瘤重、瘤体积的抑瘤率比较 实验期间各组裸鼠均未出现死亡，3组裸鼠体重无显著差异(P>0.05)；与对照组比较，低、高浓度GL63组瘤重和瘤体积明显低，抑瘤率明显高，且高浓度组瘤重和瘤体积更低，抑瘤率更高(均P<0.05)，见表2。说明GL63对裸鼠RBE移植瘤增长有明显的抑制作用。

表2 治疗后各组裸鼠体重、瘤重、瘤体积和抑瘤率的比较

2.4各组移植瘤组织病理形态 对照组肿瘤细胞形态较大，呈巢、片状排列，细胞核大且深染，核仁明显，病理性核分裂多见。肿瘤周围可见血管和淋巴管。而低、高浓度GL63组细胞与对照组相比，分化程度较高，未发现明显淋巴管侵犯和血管内瘤栓形成，见图4。提示GL63能影响裸鼠移植瘤增殖分化。PCNA蛋白表达定位于细胞核，呈棕褐色颗粒状，染色较深。对照组大部分移植瘤细胞PCNA表达阳性，而低、高浓度GL63组移植瘤细胞PCNA表达(48.5±4.1、72.3±6.4)显著低于对照组(115.2±8.3)，且高浓度GL63组肿瘤细胞PCNA表达量明显低于低浓度GL63组(均P<0.05)，见图5。说明GL63能够抑制胆管癌细胞的增殖。

2.5Western印迹检测各组移植瘤组织相关基因表达 与对照组比较，低、高浓度GL63组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著下降，而Bax和TIMP-2蛋白表达显著增高，且呈浓度依赖性(均P<0.05)，见表3、图6。

图4 各组移植瘤光镜下形态(HE染色，×400)

图5 免疫组化检测各组移植瘤PCNA蛋白表达(PCNA染色，×400)

表3 各组移植瘤组织相关基因表达比较

1～3：对照组、低浓度GL63组、高浓度GL63组图6 Western印迹检测各组移植瘤组织相关基因表达

3 讨 论

胆管癌是来源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，但由于其起病隐匿，大多数患者诊断为该疾病时已到中晚期，往往失去根治性切除机会，而目前的化疗药效果不佳，所以该疾病预后极差。因此寻找高效低毒的抗肿瘤药物对治疗胆管癌和提高患者生存期具有重要意义。国内多个研究初步显示CUR及其衍生物尤其是GL63具有广泛的抗肿瘤活性。Xiao等〔7〕实验证明GL63和CUR对正常肝细胞未发生诱导凋亡现象，说明GL63无明显毒性。本研究在体外和体内抗肿瘤实验中首次证实GL63能抑制胆管癌RBE细胞的增殖和促进其发生凋亡，且细胞周期停滞于G0/G1期。

本研究中GL63抑制了STAT3磷酸化，使STAT3无法再二聚体化，进而抑制STAT3进入细胞核内，使其调节下游基因表达能力下降，从而促进了胆管癌细胞发生凋亡。结果说明GL63在裸鼠体内有效地抑制了JAK2/STAT3信号通路，通过减少STAT3及其下游抗凋亡蛋白的表达，抑制细胞增殖和诱导其凋亡来抑制肿瘤的增长。

JAK2/STAT3信号通路在细胞增殖、凋亡、分化和免疫功能等多种生理过程中起发挥重要作用，当发生异常活化时会导致细胞出现异常增殖甚至恶变〔8,9〕。磷酸化的STAT3通过与基因的启动子区域结合来充当转录因子，以调节细胞周期进程、细胞凋亡、血管生成、肿瘤侵袭和转移〔10〕，如胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、乳腺癌和其他癌症，包括胆管癌〔11〕。STAT3调控下游靶基因包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、生存蛋白(survivin)和促凋亡蛋白Bax、Bcl-2同源拮抗剂(Bak)〔12,13〕，所以抑制STAT3的活化即可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进癌细胞凋亡〔14〕。阻断JAK2/STAT3通路成为治疗恶性肿瘤的方向之一。有研究表明GL63通过调控STAT3下游靶点，抑制人肝癌细胞HepG2和鼻咽癌细胞CNE2增殖，主要是通过内质网应激途径诱导细胞周期停滞和随后的细胞凋亡，减少Bcl-2蛋白表达，而促进Bax蛋白表达增高〔7,15〕。

转移是癌症最具破坏性的因素，也是癌症患者预后不良和死亡的主要原因。它由一系列相互关联、循序渐进的步骤组成，包括细胞黏附、细胞外基质(ECM)降解、细胞运动和侵袭。肿瘤细胞要发生迁移和侵袭，要先对ECM进行降解，而MMP-2和MMP-9是降解ECM的主要蛋白酶〔16,17〕。因此，抑制MMP表达被认为是预防癌症转移的早期靶点〔18〕。本研究结果证明GL63可抑制RBE细胞的迁移侵袭能力，且呈浓度依赖性。

PCNA在细胞核内合成，为DNA聚合酶的辅助蛋白，在细胞周期调控中发挥重要功能的核蛋白，其合成、表达与细胞周期相关。PCNA参与DNA的合成，是反映细胞增殖的重要指标，其表达在判定肿瘤良恶性和恶性程度方面有着不可替代的作用〔19〕。PCNA作为反映细胞增殖期和评定肝癌细胞核恶性度的指标会发生显著升高〔20〕。本研究结果进一步证明GL63有很好的体内抗胆管癌的作用。

综上，GL63可有效地抑制JAK2/STAT3信号通路，进而阻断STAT3磷酸化，以此影响下游蛋白表达，从而抑制了肿瘤细胞增殖和局部侵袭等恶性生物学行为并促进其凋亡。GL63在胆管癌的治疗中可发挥安全有效的抗肿瘤作用，有可能成为治疗和预防胆管癌的有效药物。