塞来昔布对离体人膝骨关节炎细胞凋亡及EGFR/MAPK信号通路的影响*

高维松，陈荣，吴国志，王隆辉，吴昌新

（海南医学院第二附属医院 骨科，海南 海口 570311）

骨关节炎又称退行性骨关节病，以关节软骨缺损、进行性软骨变性为主要病理表现，现已成为世界第4 大致残性疾病。骨关节炎发病机制尚未完全阐明，目前临床多采用对症治疗、保守治疗等，患者症状可得到部分缓解，但疗效不佳[1-2]。因此探寻有效药物提高骨关节炎疗效有重要临床意义。塞来昔布是一种非甾体类抗炎药，具有抗炎、解热等作用[3]。熊应宗等[4]研究显示，塞来昔布治疗骨关节炎短期和远期疗效显著，且安全可行。目前有关塞来昔布对骨关节炎的作用机制尚未明确。有研究证实，软骨细胞凋亡是骨关节炎发生、发展的关键，而软骨细胞外基质过度降解是软骨细胞凋亡的主要原因之一[5]。目前有关塞来昔布对骨关节炎软骨细胞生物学功能的影响少见报道，因此本研究探究塞来昔布对膝骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响，并分析相关机制，以期为膝骨关节炎的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 人膝骨关节炎软骨组织来源

膝骨关节炎软骨组织取自2021年1月—2021年12月在海南医学院第二附属医院就诊的10 例（男、女各5 例）重度膝骨关节炎行膝关节置换患者。正常膝骨关节软骨组织取自同期本院5 例因下肢严重创伤后需截肢治疗的患者（男性3 例，女性2 例，均无膝骨关节炎病史）。本研究经医院医学伦理委员会审批并通过（No：2021-016）。

1.2 主要试剂及仪器

塞来昔布，纯度：≥98%，批号：20200913（上海吉至生化科技有限公司），DMEM 培养基（上海吉至生化科技有限公司），甲苯胺蓝染液、AnnexinVFITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（上海玉博生物科技有限公司），兔抗人表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、P38 丝裂原激活蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase, P38 MAPK）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）及β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体、山羊抗兔HRP 二抗（上海臻科生物科技有限公司）。

Optima™XPN 超速离心机（美国贝克曼库尔特生物科技有限公司），NBI1000 型倒置荧光显微镜（南京先纳光学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 人膝骨关节炎软骨细胞分离及培养将人膝骨关节炎软骨组织、人正常膝骨关节组织分别置于含双抗的DMEM 培养基中，PBS 洗涤3 次，削取软骨组织块，剪碎至大小约1 mm×1 mm，于0.2%Ⅱ型胶原酶消化液中，37℃、5%二氧化碳环境下消化；消化结束后，4℃、3 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用DMEM 培养基冲洗，离心弃去上清液，重复操作3次。加入含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM 完全培养液，过滤细胞悬液，吹打悬液均匀后，接种于25 m2培养瓶中，每隔1 天更换培养基。当细胞融合至70%～80%时，用PBS 洗涤2 次，0.25%胰酶消化，镜下观察细胞形态呈圆形漂浮流动时终止消化，离心取细胞，用含10% FBS 的DMEM 完全培养基重悬细胞，细胞接种在新的培养瓶中传代培养[6]。上述细胞均至第3 代时用于后续实验。

1.3.2 甲苯胺蓝染色第3 代软骨细胞长至80%左右时，消化、离心，制成密度为1×105个/mL 的细胞悬液，接种于24 孔板（1 mL/孔，孔板提前放置盖玻片），待细胞长至盖玻片70%左右时，取出盖玻片，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗涤3 次，1%甲苯胺蓝溶液染色30 min，纯水冲洗掉多余染液，脱水封片，倒置显微镜观察并拍照[7]。

1.3.3 细胞分组取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞、人正常膝骨关节软骨细胞重悬，按1.5×105个/孔的密度接种至48 孔板，待细胞融合约80%时，更换不含FBS 的培养液。细胞分为4 组：①空白对照组：人正常膝骨关节软骨细胞不做特殊处理；②模型组：人膝骨关节炎软骨细胞不做特殊处理；③塞来昔布低、高剂量组：人膝骨关节炎软骨细胞中分别加入含终浓度为50 μmol/L、200 μmol/L 塞来昔布溶液的培养液[8]。继续培养细胞24 h，每孔设置6 复孔，每组实验重复3 次。

1.3.4 CCK-8法检测各组细胞增殖能力取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞，消化并按1.5×105个/孔的密度接种至48 孔板，严格按照CCK-8 试剂盒说明书操作，分别于培养24 h 后加入CCK-8 试剂，继续培养2 h，检测490 nm 处各孔细胞光密度（optical density, OD）值，重复3 次，取平均值[9]。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD 值/空白对照组OD 值）×100%。每组6 个复孔，实验重复3 次。

1.3.5 AnnexinV-FITC/PI 检测各组细胞凋亡取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞，PBS 溶液冲洗，弃上清液，制成密度为1×105个/mL 的细胞悬液，取100 μL加入5 μL AnnexinV-FITC 及10 μL PI（20 μg/mL）混匀，孵育30 min，流式细胞仪检测凋亡率。每组6个复孔，实验重复3 次[10]。

1.3.6 Western blotting 检测细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK 通路蛋白的表达取第3 代人膝骨关节炎软骨细胞，以RIPA 裂解并提取总蛋白，检测浓度及纯度，电泳，转膜，放入5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，分别加入一抗EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、MMP-9、Caspase-3、内参β-actin，均按照1∶500 稀释，4℃过夜，加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1∶1 000 稀释），室温孵育1 h，显影、定影，根据各蛋白条带灰度值计算目标基因蛋白相对表达量[11]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组软骨细胞形态学对比

甲苯胺蓝染色结果显示，人正常膝骨关节软骨细胞、人膝骨关节炎软骨细胞内均见蓝紫色异染颗粒，细胞核呈深蓝色，细胞质呈浅蓝色；与人膝骨关节炎软骨细胞形态比较，人正常膝骨关节软骨细胞体积较大，形态较规则，蓝紫色异染颗粒较多。见图1。

图1 两组软骨细胞形态学观察 （甲苯胺蓝染色×200）

2.2 各组细胞增殖情况比较

空白对照组、模型组、塞来昔布低和高剂量组细胞存活率分别为（100.00±0.00）% 、（45.96±6.89）%、（60.69±9.12）%和（82.78±12.45）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=47.770，P=0.000）。进一步两两比较结果：与空白对照组比较，模型组，塞来昔布低、高剂量组细胞存活率降低（P＜0.05）；与模型组比较，塞来昔布低、高剂量组细胞存活率升高（P＜0.05）；与塞来昔布低剂量组比较，塞来昔布高剂量组细胞存活率升高（P＜0.05）。

2.3 各组细胞凋亡情况比较

空白对照组、模型组、塞来昔布低和高剂量组细胞凋亡率分别为（9.98±1.50）%、（36.77±5.52）%、（28.35±4.26）%和（16.58±2.47）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=60.236，P=0.000）。进一步两两比较结果：与空白对照组相比，模型组，塞来昔布低、高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，塞来昔布低、高剂量组细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与塞来昔布低剂量组比较，塞来昔布高剂量组细胞凋亡率降低（P＜0.05）。

2.4 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK 通路蛋白相对表达量比较

空白对照组、模型组、塞来昔布低和高剂量组EGFR、p-P38 MAPK/P38 MAPK、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与空白对照组比较，模型组，塞来昔布低、高剂量组EGFR、MMP-9、Caspase-3蛋白相对表达量升高（P＜0.05），p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与模型组比较，塞来昔布低、高剂量组EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与塞来昔布低剂量组相比，塞来昔布高剂量组EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见表1 和图2。

表1 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白相对表达量比较 （±s）

表1 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与塞来昔布低剂量组比较，P ＜0.05。

组别空白对照组模型组塞来昔布低剂量组塞来昔布高剂量组F 值P 值Caspase-3 0.36±0.06 1.18±0.18①0.82±0.13①②0.55±0.09①②③49.820 0.000 EGFR 0.29±0.05 1.13±0.17①0.80±0.12①②0.58±0.09①②③56.015 0.000 p-P38 MAPK/P38 MAPK 1.27±0.19 0.31±0.05①0.69±0.11①②0.88±0.13①②③56.672 0.000 MMP-9 0.45±0.07 1.26±0.18①0.99±0.15①②0.63±0.09①②③46.524 0.000

图2 各组细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白的表达

3 讨论

膝骨关节炎是膝关节软骨进行性破坏、膝关节功能受损的一种退行性病变，目前临床仍缺乏有效治疗方法，导致多数患者关节畸形、活动受限，甚至致残，给患者生活质量及家庭带来严重影响及巨大经济负担[12]。塞来昔布是新一代非甾体抗炎镇痛药，可通过抑制环氧合酶-2 阻止前列腺素类炎症物质产生，发挥抗炎、镇痛作用[13]。王啸等[14]研究显示，塞来昔布可减轻膝关节疼痛、改善膝关节功能，进而对膝关节骨性关节炎发挥治疗作用。马瑞等[15]研究显示，塞来昔布可有效缓解早期膝骨关节炎患者关节疼痛，改善关节功能。目前塞来昔布对膝骨关节炎治疗作用的具体机制尚未明确。有研究表明，软骨细胞是膝关节软骨中主要细胞，能够合成软骨中特异性细胞外基质成分，以及合成代谢及分解代谢所需的多种因子，当软骨细胞外基质降解多于基质合成，则使软骨细胞不能摄取较多营养物质，进而导致软骨细胞凋亡，最终加重膝关节损伤[16]。

本研究体外分离并培养人膝骨关节炎软骨细胞，结果显示，与空白对照组比较，模型组及塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞存活率降低，细胞凋亡率升高；但塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞存活率比模型组升高，细胞凋亡率比模型组降低，且塞来昔布高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞存活率比低剂量组升高，细胞凋亡率比低剂量组降低，说明塞来昔布可促进人膝骨关节炎软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡。EGFR 是一种跨膜受体酪氨酸激酶，是细胞增殖及信号转导的受体之一，其活化可介导关节炎破骨细胞生长、增殖及分化等生物学过程[17]。蒋毅等[18]研究显示，过表达EGFR 可促进类风湿性关节炎破骨细胞生成及滑膜细胞生长。MAPK 是机体广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶，由3 种激酶复合物组成，其中P38 MAPK是MAPK 家族一员，能够调节关节软骨细胞生长及代谢。既往研究显示，EGFR 可抑制P38 MAPK 发生磷酸化反应，促进下游因子MMP-9 产生，MMP-9 可促进软骨细胞外基质降解，进而诱导细胞凋亡基因Caspase-3 升高，最终促进软骨细胞凋亡[19]。云昕矞[20]研究显示，上调EGFR 表达可抑制P38 MAPK 通路活化并促进软骨细胞凋亡。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型组及塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量升高，p-P38 MAPK/P38 MAPK 相对表达量降低，但塞来昔布低、高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量低于模型组，塞来昔布高剂量组人膝骨关节炎软骨细胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相对表达量低于低剂量组，说明塞来昔布可能通过抑制EGFR 表达，促进P38 MAPK 通路活化，促进离体人膝骨关节炎细胞增殖，抑制细胞凋亡，进而促进软骨细胞生长，对人膝骨关节炎软骨细胞发挥保护作用。

综上所述，塞来昔布能够促进离体人膝骨关节炎细胞增殖，抑制细胞凋亡进而促进软骨细胞生长，对人膝骨关节炎软骨细胞发挥保护作用。其作用可能是通过抑制EGFR表达，促进P38 MAPK通路活化实现的。然而本研究并未能明确塞来昔布对EGFR/P38 MAPK通路的具体调控作用，后期应进行深入阐述。