发热伴血小板减少综合征病毒温度敏感性研究

韦雪敏，李书晗，王 耀，陈梦婷，赵 丽，王志玉，万 敏，温红玲

发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)属布尼亚病毒目白纤病毒科白蛉病毒属。由其引起的SFTS是一种新发出血热疾病，病死率高达30%[1]。自2009年发现SFTSV后，其发病人数逐年增加，发病区域也在不断扩大，截至2018年已累计有25个省报告了SFTS病例[2]。SFTSV主要通过蜱叮咬传播，也可在人与人之间传播[3]，且有多项报道表明患病宠物可直接将SFTSV传染给人类[4-6]。作为一种新发病原体，目前对其生物学和理化特性的了解尚不充分。本研究主要通过观察不同温度对SFTSV病毒滴度的影响，了解其对温度的敏感性，为SFTSV的消毒和实验室生物安全防护提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞和病毒 非洲绿猴肾(Vero)细胞、实验室适应株JS2011-013-1由江苏省疾病预防控制中心惠赠。JS2011-013-1的半数细胞培养感染量(CCID50)为107.25/100 μL。

1.1.2 主要试剂及仪器 荧光显微镜由日本Olympus公司生产。DMEM培养基和青霉素-链霉素双抗购自美国Hyclone公司, FBS购自美国Gibco公司。一抗为人源SFTSV Gn蛋白单克隆抗体(由武汉大学于学杰教授课题组惠赠)[7]。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(山羊抗人IgG)购自美国Proteintech公司。

1.2 实验方法

1.2.1 温度实验 将待测病毒分装到250 μL的PCR管中，100 μL/管，分别放置在4 ℃冰箱，以及25 ℃、37 ℃、39 ℃、56 ℃、70 ℃金属浴中。间隔预定时间后，分别取出1份样品，用DMEM维持液(含1%灭活的胎牛血清，1%青霉素-链霉素双抗)对样品做10倍梯度稀释。

1.2.2 间接免疫荧光实验 Vero细胞接种到96孔板，在37 ℃、5% CO2条件下培养12～18 h(细胞汇合度70%～80%)后接种上述病毒稀释液，每个梯度设置4个平行样，并同时设置4个病毒阳性对照和空白对照。72 h后，加入-20 ℃预冷的80%丙酮固定12 h后，弃去固定液，加入人源SFTSV Gn抗体(1∶750，抗体稀释液稀释)，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次后，在避光条件下，加入FITC标记的二抗(1∶50，PBS稀释)，并在稀释液中按1∶2 000加入0.5%埃文斯蓝。混匀后，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次后在荧光显微镜下观察记录荧光孔的分布。Karber法计算病毒CCID50。

2 结 果

2.1 在4 ℃、25 ℃、37 ℃和39 ℃条件下SFTSV滴度变化 随温度的升高，病毒滴度下降速度加快，在4 ℃、25 ℃、37 ℃和39 ℃放置24 h后由107.25/100 μL分别下降到107.00/100 μL、106.75/100 μL、106.50/100 μL、105.00/100 μL(表1)。同一温度，随放置时间的延长，病毒滴度下降趋势也愈加明显，SFTSV在4 ℃、25 ℃、37 ℃放置72 h后，病毒滴度由107.25/100 μL分别下降到106.63/100 μL、106.50/100 μL、103.38/100 μL。SFTSV在39 ℃放置72 h后完全被灭活(图1)。

图1 多种温度下SFTSV随时间病毒滴度变化情况

表1 多种温度下SFTSV随时间变化灭活对数值

2.2 56 ℃、70 ℃条件下对SFTSV的作用 由表2可知，56 ℃作用180 min或70 ℃ 作用5 min后，SFTSV失去活性，荧光显微镜下无荧光出现(图2和图3)。

表2 56 ℃和70 ℃条件下SFTSV病毒滴度变化

注：60 min、120 min和180 min代表病毒原液在金属浴中的处理时间；101～103代表经过预处理的病毒原液分别稀释10倍、102倍和103倍后观察到的荧光图。

注：5 min和10 min代表病毒原液在金属浴中的处理时间；101代表经过预处理的病毒原液稀释10倍后观察到的荧光图。

3 讨 论

本研究以CCID50为107.25/100 μL SFTSV实验室适应株JS2011-013-1为对象，探索SFTSV随温度升高病毒滴度的变化规律。本次实验发现含有SFTSV的细胞培养上清液在冷藏(4 ℃)和室温(25 ℃)条件下存放72 h后，病毒滴度仅轻微下降。既往研究发现SFTSV在4 ℃条件下放置144 h，其病毒滴度仅下降约10倍[8]。本研究还发现，在37 ℃和39 ℃条件下，随时间延长，病毒滴度下降速率明显高于4 ℃和25 ℃，但存活时间仍较长，在39 ℃下放置72 h，病毒才失去感染性。这提示SFTSV离开宿主进入外环境后，仍可长时间存活并具有感染性，该特性为其自然传播提供了有利条件。SFTSV可通过接触患者血液和血性分泌物传播，甚至有研究者在感染SFTSV 12 d的雪貂体液(如尿液、唾液等)标本中检测到SFTSV[9-10]。另外，有医务人员在佩戴防流感口罩和手套的防护条件下为确诊患者气管插管后感染SFTSV[11]，提示一般防护措施并不能完全抵抗SFTSV对机体的侵袭。上述气溶胶感染案例可能是由于体内病毒载量较高的危重症患者会释放出具有感染性的小粒径气溶胶病毒颗粒[9, 11-12]，从而造成周围人员的感染。因此，应重视对接触过SFTSV的物品、SFTS患者体液沾染的物品及SFTS患者起居室的消毒。医务人员在接触危重症患者时，还需额外的预防气溶胶传播的措施，如佩戴N95口罩等。

根据既往研究[13]，除了56 ℃，我们还探究了70 ℃ 条件下SFTSV病毒滴度的变化。SFTSV在70 ℃放置5 min，病毒即被灭活；56 ℃作用180 min，病毒才失去感染性。并且本实验中所用病毒株为实验室适应株JS2011-013-1，病毒存在的环境为DMEM维持液，与离体体液中的病毒相比，其成分更简单，对病毒的保护作用更弱，温度对其作用可能更强。所以在对SFTS患者离体体液进行热灭活时，需要适当提高作用温度或延长处理时间，确保SFTSV被完全灭活。此外，外界环境中存在的介质较多，SFTSV存活时间可能相对更长。因此，对于SFTS高发地区的居民，应加强自我保护与消毒方法的宣传教育，当身边有人出现发热、胃肠道症状时，要避免接触患者体液，同时不能忽视对患者所处环境及接触过物品的消毒。

综上所述，研究者对病毒进行热灭活时，至少要70 ℃加热 5 min以上，避免病毒灭活不完全，出现实验室及医院内传播事件。

利益冲突：无

引用本文格式：韦雪敏，李书晗，王耀，等.发热伴血小板减少综合征病毒温度敏感性研究[J].中国人兽共患病学报，2022，38(1)：25-28.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.176