马尔尼菲篮状菌分泌蛋白的鉴定及功能预测分析

韦吴迪，王 刚，何锦豪，罗 强，赖菁贞,3，蒋俊俊，叶 力，梁 浩

马尔尼菲篮状菌病(Talaromycosis)是一种区域高发性机会性感染性疾病，是我国华南地区AIDS人群死亡的重要原因[1]。该病发病隐秘，临床治疗后死亡率依旧高达30%，且复发率高，因此该病的致病病原体——马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei, TM)，已被世界卫生组织列入真菌“关键病原体”清单中[2-3]。造成此现象的原因在于TM存在一套免疫逃避策略，而这很可能是通过自身分泌蛋白介导的。研究表明，毒力因子Mp1p蛋白可以抑制宿主巨噬细胞的炎症反应，发挥免疫逃逸作用[4-5]。因此，深入分析TM分泌蛋白意义重大。然而，目前TM分泌蛋白还没有得到系统地鉴定，仅停留在基于基因组的预测层面。

近年来，基于质谱技术的分泌蛋白组学在病原体毒力蛋白鉴定方面得到广泛应用[6-9]。因此，本研究采用质谱技术对TM分泌蛋白进行系统全面的鉴定，结合生物信息学手段对TM分泌蛋白的生物学功能进行分析，为后续TM免疫逃逸相关研究以及TM病的治疗提供科学依据和潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 TM菌株的来源与培养 TM菌株(ATCC18224)购自美国ATCC菌种保藏管理中心。TM接种于马铃薯斜面培养基(PDA)，28 ℃恒温培养14 d，用PBS反复冲洗培养基表面，收集孢子悬液，玻璃棉滤掉真菌丝，获得孢子滤液，14 000 g离心10 min，弃上清，PBS 洗两次。分别取108的TM孢子，放入20 mL PDA液体培养基扩大培养5 d(两重复)，取上清液进行以下实验。

1.2 主要试剂和仪器 实验中使用的主要试剂包括：二硫苏糖醇(DTT，Sigma/D9163-25G)、尿素(国药/10023218)、质谱级胰酶(Promega/V5280)、碳酸氢铵(Sigma/5330050050)、LC-MS 级乙腈(Thermo Fisher Chemical/A955-4)、LC-MS级甲酸(Thermo Fisher Scientific/A117-50)、丙酮(北京化工厂/11241203810051)。主要仪器包括：EASY-nLCTM 1200 纳升级UHPLC(Thermo Fisher/LC140)、Q ExactiveTM HF-X 质谱仪(Thermo)、电泳仪(Bio-Rad)、酶标仪(Thermo/Multiskan FC)。

1.3 总蛋白提取 每组取20 mL TM培养上清液至超滤管中，14 000 g 离心15 min，丢弃穿透液。将超滤后的样本重新置于1.5 mL离心管中，加入DB溶液(8 mol/L尿素、100 mmol/L TEAB，pH8.5)用于平衡蛋白溶液，再加入浓度10 mmol/L DTT 于56 ℃反应1 h，之后加入足量IAM，于室温避光反应1 h[10-12]。

1.4 蛋白酶解 取蛋白样品，加入DB 蛋白溶解液补足体积至100 μL，加入胰酶和100 mmol/L TEAB 缓冲液，混匀后于37 ℃酶切4 h，再加入胰酶和CaCl2酶切过夜。加入甲酸调节pH 小于3，混匀后于室温、12 000 g 离心5 min，取上清缓慢通过C18 除盐柱，之后使用清洗液连续清洗3 次，再加入适量洗脱液，收集滤液，冻干。

1.5 质谱检测 配制流动相A 液(100%水、0.1%甲酸)和B 液(80%乙腈、0.1%甲酸)。使用 A 液溶解1 μg样品进样(0.1 mg/mL)，液质检测。使用EASY-nLCTM 1200 纳升级UHPLC 系统和Q ExactiveTM HF-X 质谱仪进行二级质谱检测，生成质谱检测原始数据(.raw)。

1.6 质谱数据分析 根据UniPort蛋白数据库使用搜库软件Proteome Discoverer 2.2(PD2.2，Thermo)搜索全部的结果谱图[13]。为了提高分析结果质量，PD2.2 软件对检索结果进一步过滤：可信度在99%以上的谱肽(Peptide Spectrum Matches，PSMs)为可信PSMs，至少包含一个unique 肽段(特有肽段)的蛋白为可信蛋白，只保留可信的谱肽和蛋白，并做FDR 验证，去除FDR大于1% 的肽段和蛋白。

1.7 生物信息学分析 利用GO[13]和KEGG[14]数据库对鉴定到的蛋白质进行功能注释，以了解不同蛋白质的功能特性。使用Cell-mPLOC 2.0网站[15]预测蛋白质的亚细胞定位信息。使用SignalP网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[16]预测所鉴定蛋白的信号肽序列及其切割位点。

2 结 果

2.1 质谱鉴定的TM分泌蛋白 本实验取两个独立重复样本进行分泌蛋白鉴定，共鉴定出分泌蛋白43个，其中样本一为31个，样本二为33个。对两个样本的结果取交集，得到21个分泌蛋白(图1)，具体的分泌蛋白组分见表1。

表1 鉴定的TM分泌蛋白详细信息

图1 两个样本的TM分泌蛋白数量

2.2 鉴定的TM分泌蛋白的分子量和pI分布 本研究中鉴定的TM分泌蛋白分子量最低的为17.0 kDa(A0A5Q0PGZ4，核苷二磷酸激酶)，分子量最高的为169.1 kDa(A0A5Q0PT05，Septin型G结构域蛋白)，平均分子量为50.0 kDa(图2A)。本项研究的鉴定蛋白的pI值在5.03(A0A5Q0PBN9，该蛋白还未鉴定)到9.32(A0A5Q0PHS7，肽基脯氨酰顺反异构酶)之间，平均值为6.69(图2B)。

图2 鉴定出的TM分泌蛋白的分子量(A)和pI(B)分布

2.3 TM分泌蛋白功能注释 GO分析显示，TM分泌蛋白主要参与超氧化物代谢、压力应对、金属离子转运、氧化还原过程和DNA复制等生物学过程；主要的分子功能涵盖核酸结合、金属离子结合、水解酶活性等；蛋白质的细胞组分主要为细胞核、质膜和MCM复合体等(图3A)。而亚细胞定位分析显示，TM分泌蛋白主要定位于细胞核、细胞外、质膜、线粒体和细胞膜等(图3B)。

图3 TM分泌蛋白GO功能富集(A)和亚细胞定位(B)注释图

2.4 TM分泌蛋白通路富集 KEGG通路富集分析显示，TM分泌蛋白主要参与遗传信息、代谢以及生物系统通路。遗传信息通路为核酸折叠、分类和降解；代谢通路包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅助因子代谢、维生素代谢和核苷酸代谢；生物系统通路包括环境适应和免疫系统通路。见图4。

图4 TM分泌蛋白KEGG通路富集注释图

2.5 TM分泌蛋白信号肽及剪切位点分析 用SignalP网站预测所鉴定蛋白的信号肽序列及其切割位点，结果显示，仅有6个蛋白(A0A5Q0PEB7、A0A5Q0PMA9、A0A5Q0PPZ5、A0A5Q0PS50、A0A5Q0PYY6和A6NAD8)存在信号肽序列，其N端序列以及剪切位点信息如表2所示。

表2 TM分泌蛋白的信号肽及剪切位点信息

3 讨 论

病原体分泌蛋白在其感染致病过程中发挥着重要作用，研究表明结核分枝杆菌、沙门氏菌等可以通过分泌蛋白抑制宿主免疫杀伤作用，促进自身在巨噬细胞的存活和增值[17-19]。然而，国内外对马尔尼菲篮状菌的分泌蛋白组研究甚少，目前仅对毒力因子Mp1p的研究较为深入。因此，本研究通过质谱技术，构建了TM的分泌蛋白谱，共定性了21个分泌蛋白。生物信息学分析显示，TM分泌蛋白在真菌代谢、环境适应和免疫反应等方面发挥重要作用。

根据GO富集结果显示，TM分泌蛋白主要参与超氧化物代谢(超氧化物歧化酶)、压力应对(Septin型G结构域蛋白)和金属离子转运(镁转运蛋白)等生物学过程，这可能与TM感染介导的免疫逃逸和侵染宿主细胞有关。超氧化物歧化酶已经被证明是多种病原体的毒力因子，作为一种抗氧化酶，超氧化物歧化酶具有较强的抗炎反应，能够下调巨噬细胞产生的炎症因子、ROS等[20-21]。Septin蛋白作为一种细胞支架蛋白，可调控病原体的出芽、分裂等生理过程，同时在多种细菌侵入、感染宿主过程中扮演重要角色[22]。研究表明，金属转运蛋白也是真菌重要的毒力因子，涉及真菌致病性的多个方面[23]。本研究中鉴定的镁转运蛋白，已被证明是新型隐球菌毒力的重要调控因子[24]，但是该蛋白在TM中发挥何种作用，还需进一步研究。

Mp1p蛋白是目前研究较为明确的TM毒力因子，与超氧化物歧化酶类似，Mp1p也是一种抗炎物质，目前已知的机制是通过与花生四烯酸(AA)结合，从而抑制巨噬细胞的炎症反应[4-5]。本次研究中我们在TM分泌蛋白也鉴定出Mp1p，佐证了实验的准确性。然而，在本研究鉴定的21种蛋白中，有5种蛋白在数据库中未能找到相应注释(Uncharacterized protein)，这表明TM分泌蛋白具有较大的研究潜力。其他16种蛋白除了Mp1p外，其余均未得到深入的研究。

信号肽是蛋白质N-末端一段疏水性氨基酸序列，用于引导蛋白质转移的短肽链。蛋白质到达转运位置后，信号肽会被信号肽酶进行切除，其中真菌的信号肽酶为一型信号肽酶(SPaseI)，SignalP便是基于以上原理对分泌蛋白进行预测。本研究预测结果显示，仅有6种蛋白质存在信号肽，这提示分泌蛋白并不是都通过信号肽的方式进行转运。研究表明，真菌分泌蛋白可通过多种途径转移至胞外，包括与分泌小泡结合或进入内体亚小室、被动运输、膜翻转和膜易位等[25]。有趣的是，预测结果显示有部分分泌蛋白定位到细胞核、质膜、线粒体和细胞膜等位置，其分泌至胞外发挥何种生物学作用尚未明确，因此，未来还需要对TM分泌蛋白进行更深入的功能研究。值得注意的是，本研究使用质谱技术所鉴定的蛋白可能存在一定的假阳性，且分泌蛋白的功能分析也仅基于生物信息学推测所得，因此，未来还需使用体外实验结合生物学手段进行验证。

利益冲突：无

引用本文格式：韦吴迪，王刚，何锦豪，等.马尔尼菲篮状菌分泌蛋白的鉴定及功能预测分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(1)：19-24.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.170