橄榄油中磷脂含量测定方法学研究

◎ 杨玉琼，李 遥，魏劭恒，李佳俐，唐顺之，许文东

（广州白云山汉方现代药业有限公司 中药制药过程技术与新药创制国家工程研究中心 广东省药用脂质重点实验室，广东 广州 510240）

初榨橄榄油是木本科油料作物油橄榄树的成熟果实经过冷榨提取得到的油品，富含多酚、生育酚、角鲨烯和甾醇等多种微量营养成分，油酸含量高达55%～83%，食用橄榄油可预防心血管疾病、改善炎症和肠道菌群[1-3]。油橄榄树原生长于希腊、西班牙、意大利等地中海沿岸国家，在1964年经周恩来总理从阿尔巴尼亚引种至国内[4]。经过多年的试种和栽培，至今在我国甘肃陇南、四川广元、云南昆明、陕西城固和湖北宜昌等地区形成多个油橄榄适生区[5]。初榨橄榄油的生产是以新鲜采摘的油橄榄果为原料，采用先进的成套连续生产设备分离得到鲜榨橄榄油，最终经静置沉淀去除多余水分和杂质后得到可供食用的初榨橄榄油。国外有研究报道，在刚生产出来而未经沉淀的呈浑浊状态的初榨橄榄油中，蛋白质含量只有0.05～2.40 mg·kg-1，磷含量只有0.8～4.8 mg·kg-1（相当于磷脂含量为21～124 mg·kg-1），而在经过滤之后以及市售的初榨橄榄油和精炼橄榄油中，蛋白质和磷脂含量都明显降低[6]。这是由于初榨橄榄油生产工艺的独特性，油橄榄果中的蛋白质、磷脂等胶质成分在分离和沉淀过程中被除去，类似于油脂精炼过程的水化脱胶工序，最终使得在成品初榨橄榄油中残留极少的胶质成分[7]。由于橄榄油中磷脂含量较低，本研究通过对推荐性国家标准《粮油检验 磷脂含量的测定》（GB/T 5537—2008）[8]中的钼蓝比色法进行方法学验证，测定了国产橄榄油中真实的磷脂含量，为深入研究国产橄榄油的微量成分以及国产橄榄油的综合利用开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氧化锌（化工级，天津市福晨化学试剂厂）；盐酸（分析纯，广州化学试剂厂）；氢氧化钾、钼酸钠和硫酸联氨（均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；硫酸（分析纯，珠海市华成达化工有限公司）；磷酸二氢钾对照品（含量100.0%，中国食品药品检定研究院）；初榨橄榄油（特级，产自四川广元）；精炼橄榄油（自制）。

1.2 仪器与设备

电子天平（BSA224S-CW型，德国赛多利斯集团）、紫外-可见分光光度计（TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司）、马弗炉（SGM28型，洛阳市西格马仪器制造有限公司）、电炉（ST3006型，广东尚朋堂电器有限公司）、水浴锅（HH-6型，常州金坛精达仪器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 方法依据

依据《粮油检验 磷脂含量的测定》（GB/T 5537— 2008）中的钼蓝比色法进行橄榄油中磷脂含量方法验证和测定。

1.3.2 溶液配制

盐酸溶液：取盐酸50 mL，溶解于50 mL水中即得。5%钼酸钠稀硫酸溶液：量取140 mL浓硫酸，注入300 mL水中，冷却至室温，加入12.5 g钼酸钠，溶解后用水定容至500 mL，充分摇匀，静置24 h备用。0.015%硫酸联氨溶液：取硫酸联氨0.15 g，溶解于 1 L水中即得。氢氧化钾溶液：取50 g氢氧化钾溶解在50 mL水中即得。对照品溶液：精密称取磷酸二氢钾0.439 3 g，至100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取1mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得每1 mL含磷10 μg的标准磷溶液。供试品溶液：取供试品10 g，加氧化锌0.5 g，先在电炉上缓慢加热至样品变稠，逐渐加热至全部炭化，将坩埚送至550～600 ℃的马弗炉中灼烧至完全灰化（白色），时间约为2 h。放冷，加盐酸溶液10 mL，煮沸 5 min至残渣溶解，将溶解液过滤注入100 mL量瓶中，每次用大约5 mL热水冲洗坩埚和滤纸3～4次，待滤液冷却至室温后，用氢氧化钾溶液中和至出现浑浊，缓慢滴加盐酸溶液使氧化锌沉淀全部溶解，再加2滴，最后用水稀释至刻度，摇匀。同时制备一份 样品空白。

1.3.3 测定

精密量取标准磷溶液0 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL和8 mL，分别置50 mL比色管中，各补加水至10 mL，分别加0.015%硫酸联氨溶液8 mL，加2.5%钼酸钠稀硫酸溶液2 mL，加塞，振摇3～4次，去塞，将比色管放入沸水浴中加热10 min，取出放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置10 min。用试剂空白调整零点，在650 nm处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含磷量为横坐标（10 μg、20 μg、40 μg、60 μg和80 μg）绘制标准曲线，计算回归方程。

另精密量取供试品溶液10 mL，照标准曲线制备项下自“分别加入0.015%硫酸联氨溶液8 mL”起同法操作，用样品空白调整零点，测定其吸光度，由回归方程计算含磷量，即得。

1.3.4 计算

供试品中的磷脂含量以磷含量表示（供试品磷脂含量为供试品磷含量乘以系数26.31），按下式计算：

式中：X表示供试品中磷含量，mg·kg-1；P表示从标准曲线查得的供试品溶液的含磷量，μg；m表示供试品重量，g；V1表示供试品灰化后稀释的体积，100 mL；V2表示测定时量取供试品溶液体积，10 mL。

2 结果与分析

2.1 专属性

分别取样品空白溶液、供试品溶液和对照品溶液在400～800 nm进行波长扫描，记录光谱图（图1）。结果显示，供试品溶液与对照品溶液光谱吸收基本一致，空白溶液无干扰，说明本方法测定橄榄油中磷脂含量的专属性良好。

图1 专属性光谱图

2.2 线性和范围

取对照品溶液依法操作，在650 nm处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含磷量为横坐标绘制标准工作曲线，计算回归方程。不同含磷量对应的吸光度如表1所示，结果显示本方法在10～80 µg线性关系良好，能满足橄榄油磷脂含量测定的要求。

表1 线性和范围表

2.3 检测限和定量限

制备11份样品空白溶液，依法操作，用试剂空白调整零点，测定吸光度，按照基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法计算仪器检测限（Limit of Detection， LOD）和定量限（Limit of Quantitation，LOQ）。 LOD=3.3δ/S，LOQ=10δ/S，δ为空白响应值的偏差，S为标准曲线的斜率。仪器检测限和定量限如表2所示。本方法检测限和定量限分别为0.42 mg·kg-1和1.28 mg·kg-1。

2.4 精密度

2.4.1 重复性

取供试品10 g共6份，分别加入1 mg·mL-1的标准磷溶液0.1 mL，制成加标供试品，按照“1.3.2 溶液配制”制备成供试品溶液，并按照“1.3.3 测定”依法操作，测定吸光度，计算磷含量。如表3所示，加标供试品重复性RSD小于6%，说明本方法重复性良好。

表2 检测限和定量限表

表3 加标供试品重复性试验结果表

2.4.2 中间精密度

另制备6份加标供试品，在不同时间由不同人员依法操作，测定吸光度，计算磷含量，与重复性数据进行整合分析。如表4所示，中间精密度RSD小于6%，说明本方法中间精密度良好。

表4 中间精密度试验结果表

2.5 准确度

按照80%、100%、120%加标，制备9份加标供试品溶液，依法操作，测定吸光度，计算磷含量。准确度回收率试验结果如表5所示，平均回收率在80%～115%，RSD小于6%，说明本方法准确度良好。

2.6 耐用性

2.6.1 溶液稳定性

取加标供试品溶液5份，分别于室温放置0 h、1 h、 2 h、4 h和8 h后依法操作，测定吸光度。溶液稳定性试验结果如表6所示，溶液在8 h内测定的吸光度RSD小于6%，说明供试品溶液在8 h内测定结果稳定性较好。

表5 回收率试验结果表

表6 溶液稳定性试验结果表

2.6.2 硫酸联氨溶液用量考察

取加标供试品溶液5份，分别加入0.015%硫酸联氨溶液7.0 mL、7.5 mL、8.0 mL、8.5 mL和9.0 mL，后续依法操作，测定其吸光度。硫酸联氨溶液用量考察结果如表7所示，吸光度RSD小于6%，说明硫酸联氨溶液用量在7.0～9.0 mL对吸光度测定影响较小。

表7 硫酸联氨溶液用量考察结果表

2.6.3 钼酸钠溶液用量考察

取加标供试品溶液5份，分别加入0.015%硫酸联氨溶液8 mL，再分别加2.5%钼酸钠稀硫酸溶液 1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL、2.2 mL和2.4 mL，后续依法操作，测定其吸光度。钼酸钠溶液用量考察结果如表8所示，吸光度RSD小于6%，说明钼酸钠溶液用量在1.6～2.4 mL对吸光度测定影响较小。

2.7 橄榄油中磷脂含量测定

取3批初榨橄榄油和3批精制橄榄油样品按验证后的磷脂含量测定方法进行检测，结果如表9所示。国产初榨橄榄油的磷含量为4.57～5.27 mg·kg-1（磷脂含量为120～139 mg·kg-1），高于国外文献报道（经沉淀后初榨橄榄油磷含量1.0～1.4 mg·kg-1）[6]，经过精炼后橄榄油的磷含量则进一步降低。

表8 钼酸钠溶液用量考察结果表

表9 橄榄油样品中磷脂含量测定结果表

3 结论

通过对《粮油检验 磷脂含量的测定》（GB/T 5537— 2008）中的钼蓝比色法的方法学研究表明，检测限和定量限、线性和范围、精密度、准确度以及耐用性均符合方法学要求，能满足橄榄油中低磷脂含量的测定。同时测定结果表明国产初榨橄榄油的磷脂含量较低，虽然高于国外初榨橄榄油磷脂含量水平，但要低于传统脱胶精炼油的要求（磷含量在5～10 mg·kg-1）[9]。