液相色谱-串联质谱法检测水发产品中氨基脲

◎ 白亚敏，陈世奇，唐韵熙，江 生，兰玉坤

（1.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121；2.国家市场监管重点实验室（调味品监管技术），重庆 401121）

氨基脲是呋喃西林在动物体内的代谢物，同时也是甲壳类水产品中的内源性物质及发泡剂偶氮二甲酰胺的高温分解产物[1-4]。大量研究结果表明，氨基脲对实验动物的生殖系统、内分泌系统和免疫系统有多效性影响和改变，具有致畸性、致突变性和致癌性。氨基脲可通过食物链进入人体，影响人体健康，造成严重后果。因此，欧盟、美国、加拿大和日本等国家和组织均将呋喃西林列为动物食品中的禁用药物[5]。我国农业农村部发布的《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》也规定动物性食品中不得检出呋喃西林[6]。

毛肚、鸭肠、黄喉等水发食品在我国西南地区深受消费者喜爱，是火锅食品中消费量较大的几个品种，但其中检出氨基脲的事件时有发生。部分养殖户反映，动物食品养殖过程中并未使用呋喃西林药物，氨基脲还可能来源于水发产品的加工过程[7-8]。次氯酸盐广泛用于水发产品卫生处理和消毒，使用含次氯酸盐的消毒液处理毛肚等水发产品后，富含蛋白质的水发产品会分解出游离的氨基酸，部分氨基酸自身能分解产生氨基脲；氨基酸经次氯酸盐处理后易水解成脲基并游离出氨，氨与次氯酸盐可生成氯胺，氯胺与尿素反应生成氨基脲；氯胺与氨还能作用生成联氨，同时带酰胺基团物质与次氯酸盐作用能生成异氰酸盐，联胺与异氰酸盐反应也能产生氨基脲[9]。

近年来，氨基脲的检测方法多运用于动物食品，对生产加工中导致的污染关注较少，本文通过建立水发产品中氨基脲的高效液相色谱串联质谱（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）检测方法，为监控并掌握水发产品养殖及加工过程中氨基脲污染情况，保障食品质量安全提供了分析方法和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AB5500三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX公司）；ML-886漩涡混合器（海门市其林贝尔公司）；TD16-WS型台式高速离心机（长沙湘仪公司）；Millipore超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 材料与试剂

毛肚、鸭肠及黄喉样品购于重庆超市及农贸市场；氨基脲标准品（德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度：99.80%，批号：G151417）；氨基脲-13C-15N2标准品（WITEGA公司，纯度：99.9%，批号：31223603）；水为经处理过的超纯水；邻硝基苯甲醛（日本TGI公司，含量：＞99%）；二甲基亚砜（Sigma公司，纯 度：≥99.5%）；乙腈、甲酸为色谱纯；乙酸铵、乙酸乙酯、正己烷和磷酸氢二钾均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流 动 相：A 乙 腈（含0.1%甲 酸）， B 10 mmol·L-1乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脱程序：0～0.6 min，15%A，0.6～3.0 min，15%→85%A，3.0～4.5 min，85%A，4.5～4.6 min， 85%→15%A，4.6～6.1 min，15%A；流速：0.3 mL·min-1，柱温：40 ℃，进样体积：2 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子模式；喷雾电压：5 000 V；离子源温度：550 ℃；气帘气：270 kPa；GAS1：380 kPa，GAS2：380 kPa；质谱参数见表1。标准溶液和样品的质量色谱图见图1、图2。

表1 氨基脲衍生物和同位素内标衍生物的质谱参数表

图1 标准溶液质量色谱图

图2 样品质量色谱图

1.3.3 溶液的制备

（1）标准溶液的制备。精密称取氨基脲约10 mg，置入100 mL容量瓶，乙腈定容，摇匀，制成100 μg·mL-1的氨基脲标准储备溶液。准确移取200 μL氨基脲储备溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀，制成 200 ng·mL-1的氨基脲标准工作溶液。

（2）内标溶液的制备。精密称取氨基脲-13C-15N2标准品约10 mg，置入100 mL容量瓶，乙腈定容，摇匀，配制成100 μg·mL-1的氨基脲内标储备溶液。准确移取100 μL氨基脲内标储备溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀，制成100 ng·mL-1的氨基脲内标溶液。

（3）供试品溶液的制备。将毛肚、鸭肠及黄喉样品分别均质制样备用。称取2.0 g（精确至0.01 g）样品置于50 mL离心管中，分别用10 mL水洗涤两次，加入100 μL氨基脲内标溶液，涡旋混合50 s，再加入1 moL·L-1盐酸溶液20 mL和0.3 mL邻硝基苯甲醛衍生溶液，振荡涡旋1 min，37 ℃条件下置于恒温水浴中避光振荡反应。16 h后取出样品，冷却至室温，用1.0 moL·L-1磷酸氢二钾溶液调节pH至7.0～7.5，再加入5 mL乙酸乙酯，振荡涡旋2 min，移取上清液至离心管中，残留液中再加入5 mL乙酸乙酯，振荡涡旋后取上清液，合并上清液，40 ℃氮吹近干。准确加入1.0 mL水和2 mL正己烷，振荡涡旋溶解残余物， 6 000 r·min-1离心8 min，取下层清液过0.22 μm滤膜，待HPLC-MS/MS检测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

毛肚等水发产品中通常含有偏磷酸盐、焦磷酸盐等磷酸盐类保水剂，样品溶解于水后会形成一种缓冲盐体系，影响样品溶液的pH值调节，因此先将样品用水洗涤两次以除去其中的部分磷酸盐，但仍有部分磷酸盐不能完全去除。动物源性样品通常用0.2 moL·L-1的盐酸调节样品溶液的pH值，在酸性环境中水解蛋白质，提取其中呈结合态的氨基脲，用0.2 moL·L-1的盐酸调节水发产品样品溶液时，pH值并无太大变化。因此，将盐酸溶液的浓度调整为1 moL·L-1， 可使样品溶液的pH值调节至0～0.5，实验结果表明，使用1 moL·L-1盐酸能达到水解需要的酸性环境，检测结果较好。

2.2 色谱条件及质谱条件的优化

氨基脲分子量较小，用邻硝基苯甲醛与氨基脲进行衍生反应，将待测物分子量增加至209，可大幅提升检测灵敏度。氨基脲衍生物为氨基脲缩对醛基苯甲酸，呈弱碱性，适用于正离子监测模式。流动相采用含0.1%甲酸的乙腈-乙酸铵溶液进行梯度洗脱，甲酸和乙酸铵有助于形成待测物分子离子，提高离子化效率，增强质谱的灵敏度，同时还可改善质量色谱图峰形。由于大多数色谱柱不耐受强酸，流动相选择0.1%甲酸浓度。流动相中的离子也会抑制待测物在离子源内形成分子离子，降低氨基脲衍生物的响应，因此只采用10 mmoL·L-1乙酸铵浓度。

采用50 ng·mL-1的氨基脲衍生物进行母离子扫描，确定质荷比209.2的氨基脲衍生物分子离子，再进行子离子全扫描，选出响应强度最高的两个子离子m/z192.1和m/z166.2，其中m/z166.2作为定量离子。最后以多反应监测模式对碰撞电压和去簇电压进行参数优化，优化结果见表1。

2.3 方法学考察

2.3.1 检出限及线性关系

为减少样品基质对质谱灵敏度的影响，选用与样品相同基质的阴性样品提取液作为溶剂，准确配制氨基脲衍生物系列标准溶液。分别称取不同基质阴性样品6份，每份约2.0 g，分别置于50 mL离心管中，均加入适量1 moL·L-1盐酸溶液，涡旋30 s后，分别加入氨基脲标准工作溶液5 μL、10 μL、20 μL、 50 μL、100 μL和200 μL，添加浓度分别为0.5 μg·kg-1、 1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1，再加入氨基脲内标工作溶液100 μL（即内标含量为5.0 μg·kg-1），涡旋混合50 s，余下操作同1.3.2。以氨基脲衍生物的定量离子对的峰面积对浓度作图，绘制标准曲线，经实际加标确定方法检出限，结果见表2。

表2 线性关系、回归方程和检出限表

2.3.2 回收率

均质后的毛肚、鸭肠、黄喉阴性样品，分别称取18份，高、中、低3个浓度各6份，添加不同浓度的氨基脲标准溶液，按上述方法处理样品并测定，进行回收率试验，3种基质氨基脲的回收率为73.9%～88.0%，RSD为3.2%～8.6%，见表3。

表3 水发产品中氨基脲的回收率表

2.4 样品测定

利用本文建立的方法，对市场上100余批毛肚、鸭肠和黄喉等水发产品进行了测定。其中有13批为阳性样品，氨基脲检出含量为2.35～18.41 μg·kg-1。

3 结论

本文利用液相色谱-串联质谱技术建立了快速、准确的水发食品中氨基脲的检测方法，其准确度和重复性均满足痕量分析的需求。毛肚等水发食品中的氨基脲残留不仅是养殖过程中使用了呋喃西林，还与生产加工过程中使用的次氯酸盐消毒有关。水发产品生产企业需加强原料进货查验和生产过程控制，尽量减少氨基脲污染给人体健康带来的安全隐患。