超声波辅助猕猴桃蛋白酶对毛肚的嫩化效果研究

熊乙帆，王晓琼，李明元

（西华大学食品与生物工程学院,四川 成都 610039）

毛肚即牛胃，特指牛胃部中的第3 个间隔瓣胃[1]，作为牛的副产物，经过加工后其“脆嫩化渣”的口感受到广大消费者的喜爱，与毛肚的加工方式相关的研究具有广阔的发展潜力[2−3]。同时，毛肚中含有丰富的营养如蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素及Ca、P、Fe 等[4−5]。因未处理的毛肚生硬难嚼[6]，对毛肚进行合理的嫩化处理是必要的工序，同时为了满足消费者对健康食品日益增长的需求,相比传统的碱法嫩化，酶法嫩化是目前探究的主要方向。

目前市面上已经广泛应用了食品级NaOH 嫩化毛肚，该方法虽简单实用；但会使毛肚的营养成分严重流失，且毛肚会因为过度腐蚀而失去骨骼强度[7−9]，并且NaOH 对人体健康有一定的损害。近几年兴起的蛋白酶处理毛肚正慢慢受到消费者的信赖。木瓜蛋白酶作为主要的外源酶已被广泛地应用[10−12]，木瓜蛋白酶因价格低廉使其成为酶嫩化毛肚的主要嫩化剂。猕猴桃蛋白酶是最近兴起的新型肉类嫩化剂。王海丽等[13]研究表明，软枣猕猴桃蛋白酶能显著改善牛肉的嫩度。Aminlari 等[14]研究发现猕猴桃蛋白酶显著提高了牛肉的氮溶指数并增强了其保水性能。Toohey 等[15]研究表明，通过注射猕猴桃蛋白酶溶液，能显著降低牛肉剪切力，并具有更低的红度值。Han 等[16]研究发现在羔羊胴体中注入猕猴桃汁后，增强了蛋白水解活性，显著降解了肌原纤维蛋白。此外，超声波作为新兴的嫩化辅助措施已经得到广泛认可。Bilek 等[17]综述了超声波的空化气泡对肉类溶酶体的破坏，使肌原纤维蛋白受到破坏，以此降低肉的剪切力。Dickens 等[18]研究发现超声波处理过的鸡胸肉剪切值显著低于水对照组的剪切值。李兰会等[19]研究发现40 kHz，功率1 000 W，强度1.33 W/cm2的超声波水浴处理，明显提高了宰后山羊肉块的嫩化速率，可使山羊肉提前3 d 成熟，硬度降低，弹性升高。杨性民等[20]研究发现，超声波能显著改善虾干的嫩度并较好地保持了虾干的营养成分，降低氨基酸含量，显著减少虾干剪切力。

关于超声波辅助酶对肉类进行嫩化的研究[21−22]目前已有报道。王清波等[21]研究表明，超声波与木瓜蛋白酶有较强的协同作用，能显著降低牛肉剪切力49.0%，缩短嫩化时间。师文添等[22]研究表明，超声波与复合蛋白酶能显著改善生鲜猪肉的嫩度。但是超声波与猕猴桃蛋白酶协同嫩化毛肚的研究尚未报道。综上所述，超声波辅助猕猴桃蛋白酶具有广阔的发展前景，本文通过比较木瓜蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、NaOH 溶液在超声波辅助下对毛肚剪切力、蒸煮损失率的影响，并探究不同猕猴桃蛋白酶用量、处理温度、超声波功率对毛肚质构的影响，以期为毛肚嫩化技术提供参考，同时也有助于推动毛肚产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用的毛肚购于成都海霸王市场，−18 ℃以下配送，符合国家卫生标准，购买后，贮藏在−18 ℃冻库。

猕猴桃蛋白酶（300 U/mg），上海丽臣商贸有限公司；木瓜蛋白酶（300 U/mg），南宁庞博生物工程有限公司；食品级NaOH，成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-8 恒温水浴锅，江苏省金坛市瑞华仪器有限公司；LC-SY5001 型电磁炉，佛山市顺德区韩泰电器有限公司；TA-XT PLUS 型质构仪，英国Stable Micro Systems 公司；VS22-80AA 型超声波清洗仪，无锡沃信仪器制造有限公司；PHSJ-6L 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 毛肚预处理

将毛肚从−18 ℃冷冻室取出，在0～4 ℃条件下进行解冻至毛肚中心温度达到0 ℃以上，去除掉毛肚表面杂质，并用小刀刮去毛肚外部的脂层薄膜，洗净，顺着毛肚的肌纤维方向将其切成3 cm×6 cm×6 cm 的毛肚片，然后将其置于沸水锅中烫煮30 s 进行定型，捞出冷却至室温，用滤纸吸干毛肚表面水分，切成5 g 小片，待用。

1.3.2 超声波辅助下不同嫩化剂对毛肚剪切力、蒸煮损失率的影响

分别将5 g 毛肚放入200 mL，25 ℃，0.6%猕猴桃蛋白酶溶液、0.6%木瓜蛋白酶溶液、0.6%NaOH溶液中浸泡，根据已有文献[6，9，12，22]固定酶处理时间为30 min，然后将浸泡液和毛肚装入13 cm×19 cm的高温蒸煮袋中抽真空，再进行40 kHz、300 W 超声波水浴处理15 min 后捞出。对处理后的毛肚进行剪切力、蒸煮损失率测定，平行测定3 次，取平均值，分组采用水作为空白对照组C、猕猴桃蛋白酶组T1、木瓜蛋白酶组T2、NaOH 溶液组T3，比较几种处理方式对毛肚嫩化效果的影响。

1.3.3 质构的测定

将毛肚切成20 mm×20 mm×20 mm 的切块，分成3 组，每组取10 个平行样品，使用TA-XT PLUS型质构仪采用HDP/BSK 探头对剪切力进行测定，采用TA36 探头测定硬度、咀嚼型、弹性。设置参数：测前及测后速度为3 mm/s，测中速度为1 mm/s，压缩样品高度80%，时间2 s，触发类型自动，触发力5 g，平行测定3 次，取平均值。

1.3.4 蒸煮损失的测定

参照GB 5009.3—2016 食品中水分的测定相关操作，将嫩化处理后的毛肚分成3 组，每组取10 个平行样品，对蒸煮过程中流出的汁液进行分析。用总流出液表示蒸煮损失，损失率越低表示保水性越好，蒸煮前称重得m1，蒸煮后沥干流出液称重得m2，计算蒸煮损失率R，见式(1)。

式中：R为蒸煮损失率；m1为蒸煮前质量；m2为蒸煮后沥干流出液质量。

1.3.5 超声波辅助猕猴桃蛋白酶嫩化毛肚实验

1.3.5.1 超声波辅助下不同猕猴桃蛋白酶用量对毛肚质构的影响

将预处理后的毛肚放入20 ℃猕猴桃酶溶液中浸泡30 min，调节酶用量分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，再放入40 kHz、50 W 超声波清洗仪中进行水浴处理15 min。

1.3.5.2 超声波辅助下不同处理温度对毛肚质构的影响

将预处理后的毛肚放入0.5%猕猴桃蛋白酶溶液中浸泡30 min，调节温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃，再放入40 kHz、50 W 超声波清洗仪中进行水浴处理15 min。

1.3.5.3 不同超声波功率对毛肚质构的影响

将预处理后的毛肚放入50 ℃，0.5%猕猴桃蛋白酶溶液中进行浸泡30 min，调节超声波处理功率分别为0、50、100、150、200、250、300 W，频率40 kHz 的超声波进行水浴处理15 min。

1.3.6 实验数据统计分析

组间数据采用SPSS17.0 软件中的One-way ANOVA 程序，显著水平为0.05，当P＜0.05 时差异显著，结果以（a、b、c）表示，不同字母表示有显著差异性。试验数据采用Origin8.5 进行统计并绘图。所有实验重复两次。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助下不同嫩化剂对毛肚剪切力及蒸煮损失率的影响

由图1 可知，超声波辅助下猕猴桃蛋白酶、木瓜蛋白酶、NaOH 溶液对毛肚剪切力、蒸煮损失率影响均显著（P<0.05），NaOH 溶液处理下剪切力达到最低值12.1 N，但NaOH 溶液处理后的毛肚蒸煮损失远大于对照组（P<0.05），蒸煮损失率达到67.2%。李凛等[3]研究表明NaOH 溶液通过破坏毛肚内部组织使毛肚吸入大量水分以提高嫩度，因此NaOH溶液的过度腐蚀会导致毛肚保水性严重下降，使其蒸煮后水分大量流失，与实际生活中碱发毛肚经漂烫后缩水严重、口感较差现象相符。同时，NaOH本身作为一种强碱对人体健康有一定损害。猕猴桃蛋白酶相比木瓜蛋白酶具有更大剪切力影响（P<0.05），比对照组下降了33%。Kamphuis 等[23]研究表明，猕猴桃蛋白酶具有较好的结缔组织溶解效率，而毛肚作为内脏，其结缔组织占比较高，因此嫩化效果更好。同时，猕猴桃蛋白酶与木瓜蛋白酶同属植物半胱氨酸蛋白酶，具有相似的组成序列和作用方式[12]；因此均降低了毛肚的蒸煮损失率，而猕猴桃蛋白酶相比木瓜蛋白酶使毛肚的蒸煮损失率更小（P<0.05），更好地保留了毛肚中的水分，蒸煮损失率达到最低值17.8%。黄彩燕等[12]研究表明，猕猴桃蛋白酶具有高度专一性，能够提高肉类嫩度，并具有一定的保水性。周珠法等[24]等研究表明，木瓜蛋白酶能显著提高牛肉的持水力，降低烹饪失水率。明建等[25]研究表明，蛋白酶处理显著降低了牛肉蒸煮损失率、剪切力、咀嚼性、弹性等物性指标。

图1 超声波辅助下不同嫩化剂对毛肚剪切力、蒸煮损失的影响

综上所述，超声波辅助下猕猴桃蛋白酶处理的毛肚剪切力较小，保水性更好，嫩化效果明显，所以选择其进行后续研究。

2.2 超声波辅助猕猴桃蛋白酶嫩化毛肚实验

2.2.1 超声波辅助下不同猕猴桃蛋白酶用量对毛肚质构的影响

由表1 可知，当猕猴桃蛋白酶用量在0%～0.1%时，毛肚剪切力、硬度、弹性未发生显著性变化（P>0.05），说明低含量猕猴桃蛋白酶对毛肚质构影响不大；随着猕猴桃蛋白酶用量的增加，剪切力、硬度和咀嚼性变小，弹性变大，毛肚的质构得到显著优化（P<0.05）。王清波等[21]研究表明酶使牛肉肌肉组织的细胞膜受压破坏，使Ca2+离子释放，激活钙激活蛋白酶使蛋白质水解，肌肉及肌肉组织间连接被破坏，弹性和嫩度增加。当猕猴桃蛋白酶用量在0.6%时毛肚质构指标大幅度下降，相比0.5%时平均下降27.13%，可能是由于在猕猴桃蛋白酶用量大于0.5%时，毛肚内肌原细胞结构被大幅度破坏，细胞间质大量流出，导致口感严重下降。

表1 超声波辅助下不同酶用量对毛肚质构的影响

综上所述，当猕猴桃蛋白酶用量为0.5%时，毛肚质构属性最佳，因此选择0.5%进行后续研究。

2.2.2 超声波辅助下不同处理温度对毛肚质构的影响

由表2 可知，当温度在20～50 ℃时，随着温度的升高，毛肚的剪切力、硬度和咀嚼性变小,弹性变大，质构得到显著优化（P<0.05），可能是因为随着温度的升高，猕猴桃蛋白酶的酶活力得到进一步释放，促进了酶处理效率；当温度在50～70 ℃时，随着温度的升高毛肚剪切力显著上升（P<0.05），质构指标变差，口感下降。Han 等[16]研究表明，猕猴桃蛋白酶在高温条件下变性失活，羊肉肌纤维收缩加剧，细胞间隙减小，弹性下降。

表2 超声波辅助下不同处理温度对毛肚质构的影响

综上所述，当温度为50 ℃时，毛肚剪切力最小，硬度、咀嚼性较小，弹性较大，因此选择50 ℃进行后续研究。

2.2.3 不同超声波功率对毛肚质构的影响

由表3 可知，当超声波功率在0～50 W 时，毛肚质构指标变化不显著（P>0.05），可能是因为低功率超声波无法穿透毛肚外表层，无法有效作用于毛肚内部肌原纤维；随着功率的升高，毛肚剪切力、咀嚼性、弹性都得到显著优化（P<0.05）。Dickens 等[18]研究表明，超声波能破坏鸡胸肉肌原纤维蛋白、结缔组织、溶酶体，剪切力和咀嚼性下降。由表3可知，超声波对毛肚的硬度影响不显著（P>0.05），可能与超声波的作用机制有关，空化效应无法改变毛肚外表层硬度，具体原理待验证。当功率在300 W 时，毛肚剪切力、咀嚼性显著上升（P<0.05），弹性显著下降（P<0.05），导致口感严重下降。这与师文添等[22]的研究结论相符。他们发现超声波同酶对嫩化生鲜猪肉有一定协同作用，但超声波功率过高会破坏酶结构，使其活性降低，嫩化效果下降。

表3 不同超声波功率对毛肚质构的影响

综上所述，当超声波功率为250 W 时，毛肚质构属性最佳，因此选择250 W 作为最佳功率。

3 结论

超声波辅助下NaOH 溶液、猕猴桃蛋白酶、木瓜蛋白酶均使毛肚剪切力显著下降（P<0.05），NaOH 溶液处理下剪切力达到最低值12.1 N；但是NaOH 溶液使毛肚蒸煮损失率高达67.2%，且严重影响漂烫后毛肚的品质与口感。猕猴桃蛋白酶相比木瓜蛋白酶对剪切力的影响更大（P<0.05），相比对照组下降了33%，嫩化效果明显。同时，猕猴桃蛋白酶使毛肚蒸煮损失率降低，具有一定保水性，因此超声波辅助猕猴桃蛋白酶效果最佳。超声波辅助猕猴桃蛋白酶处理毛肚的最佳条件是猕猴桃蛋白酶用量0.5%、温度50 ℃、超声波功率250 W，此条件下毛肚质构属性最佳，口感最好。本实验结果证实，超声波辅助猕猴桃蛋白酶对毛肚的嫩化效果显著，同时可以提高毛肚的保水性、减少蒸煮损失，提高口感，可作为一种新型的毛肚嫩化技术。