苦参碱调节AMPK/SIRT3信号通路对高脂饮食诱导肥胖症大鼠心功能的影响Δ

盛蓉辉，张 松，王丽娟

(1.西安市儿童医院心内科，西安 710003； 2.空军第九八六医院药剂科，西安710032； 3.西安市儿童医院感染科，西安 710003)

近年来，随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变，肥胖症的发病率逐年升高，已经成为全球性的公共健康问题[1]。肥胖症也是多种心脑血管疾病，如高血压、高脂血症、糖尿病、肿瘤和动脉粥样硬化等发生发展的重要危险因素[2-3]。因此，寻找治疗与预防肥胖症的有效手段，对于降低各种心脑血管疾病发生率具有关键意义。研究结果表明，常规药物、手术，以及控制饮食、加强运动等手段治疗肥胖症都存在一些不良反应，且极易复发[4]。中药已被证实在防治肥胖症方面具有明显的效果[5]。因此，寻找更多、更有效的中药治疗肥胖症已成为必然趋势。苦参碱为中药苦参的主要活性成分，具有抗炎、抗菌以及抗肿瘤等作用[6-7]，现已被广泛用于肥胖症、糖尿病等相关疾病的治疗[8]。但苦参碱对于肥胖症大鼠心功能的影响尚无研究报道。研究结果发现，脓毒性心肌病中沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)过表达以及AMP活化蛋白激酶(AMPK)通路激活会促进线粒体内生物合成，从而改善心肌细胞死亡[9]。在氧化应激相关的慢性心肌损伤中，AMPK和SIRT3下调是导致心肌细胞损伤的主要分子机制[10]。本研究通过高脂饮食诱导建立肥胖症大鼠模型，探讨苦参碱能否通过调控AMPK/SIRT3信号通路，发挥对肥胖症大鼠心功能的保护作用。

1 材料

1.1 实验动物

6周龄SPF级SD雄性大鼠，体重为(200±20) g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号为SCXK(京)2018-0002。实验动物适应性饲养1周，期间自由饮水采食，温度控制在(22±2) ℃，相对湿度为(55±5)%，昼夜周期为1∶ 1。

1.2 仪器

TY-6868A-1型超声诊断仪(上海聚慕医疗器械有限公司)；迈瑞BC-30Vet型兽用全自动血液细胞分析仪(北京赛百奥科技有限公司)；Azure Biosystems C150型凝胶成像系统[普迈精医科技(北京)有限公司]。

1.3 药品与试剂

普通饲料、高脂饲料(北京华阜康生物科技有限公司，批号为1024、H10060)；苦参碱(成都植标化纯生物技术有限公司，批号为PCS0572)；二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，规格为0.5 g/片，批准文号为国药准字H20023370)；AF488标记的麦胚凝集素(WGA，美国AAT Bioquest公司，批号为25500)；兔抗大鼠一抗p-AMPK、AMPK、SIRT3、GAPDH、HRP标记的羊抗兔二抗(ab6721)(英国Abcam公司，批号为ab133448、ab207442、ab246522、ab8245、ab6721)。

2 方法

2.1 建模与分组

将若干SD大鼠分为两组，其中10只大鼠给予普通饲料作为空白组，其余大鼠给予高脂饲料建立高脂饮食诱导肥胖症大鼠模型，每周称取1次体重。饲喂2周后，淘汰体重增加较少的大鼠，挑选出50只大鼠继续给予高脂饲料6周，空白组大鼠依然给予普通饲料。造模结束后，将50只模型大鼠随机分为五组，即模型组，二甲双胍组(20 mg/kg)，苦参碱低(7.5 mg/kg)、中(15 mg/kg)和高(30 mg/kg)剂量组，每组10只[11]。连续给药6周，期间空白组大鼠给予普通饲料，其余五组大鼠给予高脂饲料。开始给药时(给药开始)与实验结束后(给药结束)各称取1次体重。

2.2 大鼠心功能测定

麻醉大鼠后，左侧卧位固定，胸部剪毛后涂抹耦合剂，运用超声诊断仪，选取左心室长轴与乳头肌水平短轴切面，检测并记录各组大鼠左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期容积(LVEDV)和左心室收缩末期容积(LVESV)。每只大鼠各取3个完整心动周期的平均数值作为最终检测结果。

2.3 大鼠静脉血中血糖、胰岛素水平检测

实验结束前禁食12 h，取静脉血，采用全自动分析仪测定各组大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平。

2.4 心肌组织WGA染色

处死大鼠，分离左心室心肌组织，以PBS冲洗干净后用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水后石蜡包埋、切片。将切片采用常规方法脱蜡水合，滴加胰酶工作液孵育后以PBS漂洗，加入WGA工作液，避光温箱孵育2 h，以PBS清洗，加入封固剂封片，于光学显微镜400倍下观察拍照。通过Image-Pro Plus 8.0软件选取合适视野，测量视野内心肌组织面积及细胞核总数，得出单个心肌细胞表面积。单个心肌细胞表面积(mm2)=组织面积(mm2)/细胞核总数。

2.5 蛋白质印迹法检测心肌组织AMPK/SIRT3相关蛋白表达水平

处死大鼠，分离左心室心肌组织，加入蛋白裂解液匀浆后，再采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度，上样进行电泳、转膜，4%脱脂牛奶封闭2 h，清洗后加入兔抗大鼠一抗p-AMPK、AMPK、SIRT3和GAPDH，4 ℃下孵育过夜，清洗后再加入HRP标记的羊抗兔二抗室温(25 ℃)下孵育2 h，清洗后采用ECL显色试剂盒进行显色操作，通过凝胶成像系统收集图像，进行灰度值分析。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 六组大鼠体重变化比较

给药开始前，与空白组比较，模型组、二甲双胍组和苦参碱各剂量组大鼠体重均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。给药结束后，与空白组比较，模型组大鼠体重显著增加；与模型组比较，二甲双胍组和苦参碱各剂量组大鼠体重明显降低；与二甲双胍组比较，苦参碱低、中剂量组大鼠体重明显增加，上述差异均有统计学意义(P<0.05)；与二甲双胍组比较，苦参碱高剂量组大鼠体重有增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；苦参碱各剂量组大鼠体重的变化具有剂量效应，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 六组大鼠体重比较Tab 1 Comparison of body weights among six groups

3.2 六组大鼠心功能变化比较

与空白组比较，模型组大鼠的LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平明显升高，LVEF、LVFS水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和苦参碱各剂量组大鼠的LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平明显降低，LVEF、LVFS水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；苦参碱各剂量组大鼠上述指标的变化具有剂量效应，差异有统计学意义(P<0.05)；苦参碱高剂量组与二甲双胍组大鼠上述指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2—3。

表2 六组大鼠LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平比较Tab 2 Comparison of LVESD, LVEDD, LVEDV and LVESV among six groups of rats

表3 六组大鼠LVEF、LVFS水平比较Tab 3 Comparison of LVEF and LVFS among six groups

3.3 六组大鼠静脉血中血糖、胰岛素水平比较

与空白组比较，模型组大鼠FBG、FINS水平明显升高；与模型组比较，二甲双胍组和苦参碱各剂量组大鼠FBG、FINS水平明显降低；与二甲双胍组比较，苦参碱低、中剂量组大鼠FBG、FINS水平明显升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。苦参碱高剂量组大鼠上述指标水平较二甲双胍组有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；苦参碱各剂量组大鼠上述指标的变化具有剂量效应，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 六组大鼠FBG、FINS水平比较Tab 4 Comparison of FBG and FINS levels among six

3.4 六组大鼠左心室心肌细胞表面积变化比较

WGA染色结果显示，与空白组比较，模型组大鼠心肌细胞表面积明显增加；与模型组比较，二甲双胍组和苦参碱各剂量组大鼠心肌细胞表面积明显降低；与二甲双胍组比较，苦参碱低、中剂量组大鼠心肌细胞表面积明显增加，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、表5。苦参碱高剂量组与二甲双胍组大鼠心肌细胞表面积比较，差异无统计学意义(P>0.05)；苦参碱各剂量组间大鼠心肌细胞表面积的变化具有剂量效应，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表5。

A.空白组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.苦参碱低剂量组；E.苦参碱中剂量组；F.苦参碱高剂量组A.blank group; B.model group; C.metformin group; D.low-dose matrine group; E. medium-dose matrine group; F. high-dose matrine group图1 六组大鼠左心室心肌细胞表面积的变化(WGA, ×400)Fig 1 Changes of the surface area of myocardial cells in left ventricle in six groups of rats (WGA, ×400)

表5 六组大鼠左心室心肌细胞表面积比较Tab 5 Comparison of the surface area of myocardial cells in left ventricle among six groups of rats

3.5 六组大鼠心肌组织中p-AMPK、AMPK、SIRT3蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表达水平明显降低；与模型组比较，二甲双胍组和苦参碱各剂量组大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表达水平明显升高；与二甲双胍组比较，苦参碱低、中剂量组大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表达水平明显降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、表6。苦参碱高剂量组上述蛋白表达水平与二甲双胍组比较有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；苦参碱各剂量组大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表达的变化具有剂量效应，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表6。

A.空白组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.苦参碱低剂量组；E.苦参碱中剂量组；F.苦参碱高剂量组A.blank group; B.model group; C.metformin group; D.low-dose matrine group; E.medium-dose matrine group; F.high-dose matrine group图2 六组大鼠心肌组织中p-AMPK、AMPK和SIRT3蛋白表达水平Fig 2 Expression of p-AMPK, AMPK and SIRT3 protein in myocardial tissues in six groups of rats

表6 六组大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK、SIRT3蛋白表达水平比较Tab 6 Comparison of p-AMPK/AMPK and SIRT3 protein expression in myocardial tissues among six groups

4 讨论

肥胖症为慢性代谢紊乱疾病，其发病率升高是多种心脑血管疾病发病风险升高的重要因素。肥胖症可引起血脂、血糖代谢异常以及胰岛素抵抗，导致心功能改变和心肌细胞肥大[12]。但其机制较为复杂。本研究通过高脂饮食诱导建立肥胖症大鼠模型，结果发现，模型组大鼠体重增加，FBG、FINS水平升高，提示大鼠体内发生血糖代谢紊乱以及胰岛素抵抗；模型组大鼠心功能指标LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平明显升高，LVEF、LVFS水平明显降低，提示模型组大鼠左心室心肌组织增厚，舒张功能发生障碍，心功能出现代偿性增强。通过WGA染色结果进一步验证，模型组大鼠心肌细胞表面积增加，提示心肌组织增厚，导致心功能改变、心室舒张功能障碍。

苦参碱可以改善肥胖症和糖尿病，目前已被广泛用于乙型肝炎以及多种心血管疾病的临床治疗[13-14]。本研究结果表明，与模型组比较，苦参碱干预后的高脂饮食诱导肥胖症大鼠体重降低，FBG、FINS水平降低，提示苦参碱可以逆转大鼠体内的血糖代谢紊乱和胰岛素抵抗；LVESD、LVEDD、LVEDV和LVESV水平降低，LVEF、LVFS水平升高，提示苦参碱可有效减轻左心室心肌组织增厚，提高心肌舒张功能，保护心功能。二甲双胍是目前临床治疗糖尿病的一线药物，本实验中其作为苦参碱的阳性对照，证实了苦参碱对高脂饮食诱导肥胖症大鼠的糖代谢紊乱有显著调节作用。

SIRT3是高度保守的、依赖于NAD+的线粒体蛋白，在机体中通过去乙酰化修饰蛋白，涉及多个细胞过程[15]。研究结果发现，SIRT3可以通过调节线粒体功能，调控心脏的能量代谢，对心功能起到保护作用[16]。有研究结果证实，红景天苷能够通过激活线粒体生物发生、AMPK的磷酸化以及SIRT3来保护糖尿病心肌病小鼠的心脏功能[17]。AMPK是细胞中的能量传感器，在机体中参与调节能量代谢，越来越多的研究结果证实，AMPK调节线粒体生物学，具有维持代谢和内环境稳态的作用[18]。SIRT3是AMPK下游的关键调控因子，研究结果表明，药物干预激活AMPK/SIRT3信号通路可以明显改善由氧化应激介导的心血管疾病，且可以有效逆转脂多糖引起的心肌收缩舒张功能降低，减轻心肌肥厚以及抑制心肌纤维化，起到对心脏的保护作用[19-21]。苦参碱可保护心肌细胞免受缺血/再灌注损伤，通过激活心肌细胞中的AMPK/SIRT3通路来减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞死亡[22]。本研究结果显示，与模型组比较，苦参碱各剂量组大鼠心肌组织中p-AMPK、AMPK和SIRT3蛋白表达水平升高，说明苦参碱能够通过激活AMPK/SIRT3通路而抵抗心肌组织肥厚以及舒张功能障碍，保护高脂饮食诱导的肥胖症大鼠的心功能。

综上所述，苦参碱可减轻高脂饮食诱导的肥胖症大鼠左心室心肌组织增厚，提高心肌舒张功能，保护心功能，可能与AMPK/SIRT3通路的激活有关，但其具体机制还需结合临床研究进一步验证。