气相色谱法测定腌萝卜中甜蜜素不确定度分析报告

罗慈婷

（1.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442；3.广东省食品质量监督检验站，广东广州 511442）

甜蜜素是一种化学甜味剂，主要用于提高食品的甜度，其效果和口感良好，被应用于我国的食品加工业。常用的食品甜蜜素检测方法有色谱法[1]。适量的甜味剂能够赋予食品更舒适的味道，但过量添加会对人体健康造成不良影响。甜蜜素在体内不参与机体代谢，大剂量摄入会导致腹泻，造成胃肠道损伤，加重人体肝脏负担，并具有潜在致癌性[2]。甜蜜素根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）的规定，腌渍的蔬菜其最大使用量为1.0 g/kg。按照《测量不确定度评定与表示》分析不确定度的因素并统计相关结果。

1 材料与方法

1.1 材料

腌萝卜，购自番禺区超市。

1.2 试剂与标准品

甜蜜素（纯度≥99.4%，Dr.Ehrenstorfer）、正庚烷、亚硝酸钠、硫酸与氯化钠。

1.3 仪器设备

气相色谱仪；天平；离心机；超声机；旋涡混合器。

1.4 实验方法

1.4.1 试剂配制

（1）环己基氨基磺酸标准储备液（5.0 mg/mL）的配制。称取141.53 mg 标准品，用水溶解并定容至25.0 mL，混匀[3]。

（2）标 准 使 用 液（1.0 mg/mL）的 配 制。移 取20.0 mL 己基氨基磺酸标准储备液，用水定容至100 mL[3]。移取1.00 mg/mL 标准使用液0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL、10.00 mL 以及25.00 mL于50 mL 容量瓶中，加水定容，配成标准溶液浓度分别为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL 和0.50 mg/mL。环己基氨基磺酸标准使用液临用时配制以备衍生化用。准确移取标准系列溶液10.0 mL，按照《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》（GB 5009.97—2016）第一法衍生化操作[3]。

1.4.2 测定方法

按GB 5009.97—2016 第 一 法， 用Agilent 7890B气相色谱仪测定腌萝卜中甜蜜素的含量，经过水提取定容，取10 mL 样液衍生化操作后，取上清液供气相色谱测定[3]。

1.4.3 色谱条件

升温程序：按GB 5009.97—2016 要求，初始温度为55 ℃，以10 ℃/min 的速率升温至95 ℃后保持0.5 min，再以30 ℃/min 升温至200 ℃后保持3 min；进样口温度：240 ℃；检测器温度：280 ℃；流速：5.0 mL/min；氢气流量：40 mL/min；空气流量：350 mL/min[3]。

1.4.4 数学模型

甜蜜素的数学模型为：

式中：X为甜蜜素含量，g/kg；C为甜蜜素的浓度，mg/mL；V3为正庚烷定容体积，mL；m样为待测样品的取样量，g；V1为样品处理后定容体积，mL；V2为萃取甜蜜素所取试样液体积，mL。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据测定方法的主要步骤，不确定度主要来源于：①标准品；②天平使用过程；③定容及移取过程；④拟合曲线；⑤仪器及多次测量重复性等引入。具体见图1。

图1 甜蜜素不确定度来源

2.2 不确定度计算过程

2.2.1 标准物质引入的不确定度

甜蜜素标准物质的提供商为Dr.Ehrenstorfer，该标物证书纯度99.12%，扩展不确定度为4.48%，为正态分布，包含因子k=2，其标准不确定度为=2.24%， 相对标准不确定度为=0.0226。

（1）标准储备液引入的不确定度。使用天平称取甜蜜素141.53 mg 的标准品，用水定容至25 mL 容量瓶，查验其证书得知扩展不确度U=0.04 mg（k=2），其相对标准不确定度为=0.02mg ，其相对标准不确定度为=0.000142；查阅《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），A 级25 mL容量瓶的容量允许差为±0.030 mL[4]，，则引入的标准不确定度为=0.0174mL ，相对标准不确定度为=0.000696；玻璃器皿使用过程中引起的不确定性用计算温度范围和体积膨胀系数来评估。玻璃器皿的体积膨胀明显小于液体，因此只考虑温度变化即可。水的体积膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，由温度起 伏 引 起 体 积 偏 差 为V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，此过程引入的相对标准不确定度为=0.00122；于是由储备液引入的相对标准不确定度为：

（2）标准使用液引入的不确定度。使用10 mL移液枪移取5.0 mg/mL 标准储备液10 mL，用水定 容 至50 mL 容 量 瓶， 得1.000 mg/mL 标 准 中间 液。 按JJG 646—2006 规 定， 使 用1 ～10 mL移液枪时，其中10 mL 规格容量允许误差为±0.6%[5]，，此过程引入的相对标准不确定度为=0.00347；在20 ℃校准移液枪时， 温 度 在（20±5） ℃起 伏， 此 过 程 引 起 的不确定度用该温度范围系数来评定，水的体 积 膨 胀 系 数 为2.1×10-4℃-1， 当 温 度 起 伏时 引 起 体 积 偏 差 为V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，此过程引入的相对标准不确定度为=0.00122；根据JJG 196—2006，容量瓶为A 级50 mL 的容量允许差为±0.05 mL[4]，，此过程引入的标准不确定度为=0.0289mL ，其相对标准不确定度为=0.000578；在20 ℃校准玻璃器皿，温度在（20±5） ℃起伏。此过程引起的不确定度用温度范围和体积膨胀系数来评定。玻璃器皿的体积膨胀明显小于液体，因此只考虑温度变化即可。水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，由于温度起伏引起体积偏差为V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，温度变化引入的相对标准不确定度为urel(P2D)==0.00122；溶液稀释配制过程中引入的相对标准不确定度为：

（3）合成标准物质引入的不确定度。合成的标准物质相对标准不确定度由物质纯度、储备液配制和中间液配制过程中引入，则合成标准物质引入的相对标准不确定度为：

2.2.2 样品称量

依据GB 5009.97—2016，使用天平称取样品5.00 g，该天平检定证书给出的0～50 g（0～50 000e，e=10 d，d=1 mg）称量范围的允许误差MPE=±0.5 mg，用5 g砝码校正天平，由检定证书给出的扩展不确定度为Us=0.03 mg(k2=2)，用天平分别称取腌萝卜6 次，结果数据分别为5.002 4 g、5.002 1 g、5.002 4 g、5.002 3 g、5.002 3 g 和5.001 8 g，均值为5.002 2 g，方差S2=0.000 000 053 7。算得其合成标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

2.2.3 前处理萃取和定容试液

（1）样品处理后容量瓶定容体积引入的不确定度。用样液转移至50 mL 容量瓶中，加水定容。按JJG 196—2006 规定，（A 级）50 mL 容量瓶的容量允许差为±0.05 mL[4]，，此过程的引入的标准不确定度为=0.0289mL ，相对标准不确定度为=0.000578；在20 ℃校准玻璃器皿，实验室的温度在（20±5） ℃起伏。玻璃器皿的体积膨胀明显小于液体，因此只考虑温度变化即可。水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，由温度起伏引起体积偏差为V1×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，由温度起伏引入的相对标准不确定度为：

样品合成处理后容量瓶定容体积引入的相对标准不确定度为：

（2）衍生化试液引入的不确定度。用10 mL 移液枪移取10 mL 上清液进行衍生化。按JJG 646—2006规定，使用1 ～10 mL 移液器时，其中10 mL 规格检定点的容量允许误差为±0.6%[5]，，此过程引入的相对标准不确定度为=0.00347；在20 ℃校准移液枪，温度在（20±5） ℃起伏，此过程引起的不确定度可用温度范围系数来评定，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，由温度起伏引起的体积偏差为V2×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，由温度起伏引入的相对标准不确定度为urel(V2B)==0.00122，合成甜蜜素衍生化所取试样液体积引起的相对标准不确定度为：

（3）正庚烷试液引入的不确定度。用10 mL 移液器移取5 mL 正庚烷定容，按JJG 196—2006[4]规定，使用1 ～10 mL 移液器时，5 mL 规格检定点的容量允许误差为±0.6%，，此过程引入的相对标准不确定度为=0.00347。在20 ℃校准移液枪，温度在（20±5） ℃起伏。此过程的不确定度用温度范围和体积膨胀系数来评定。正庚烷的体积膨胀系数为1.24×10-3℃-1，由温度起伏引起体积偏差为V3×10 ℃×1.24×10-3℃-1，，此过程引入的相对标准不确定度为urel(V2B)==0.00716；正庚烷定容体积引起的合成相对标准不确定度为：

（4）样品前处理试液引入的不确定度。样品前处理的相对标准不确定度由样品处理后定容、甜蜜素衍生化所取试样液、正庚烷定容体积引入，则合成相对标准不确定度为：

2.2.4 样品浓度试液引入的不确定度利用校准曲线来表示甜蜜素的浓度，配制6 个校准溶液的浓度分别为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL 和0.50 mg/mL。根据以上数据得到平均值为=0.1467mg/mL，每个点各测量3 次，峰面积和浓度测定结果见表1，根据表1 进行线性回归方程式拟合，结果见表2。

表1 峰面积和浓度测定结果

表2 检出限和线性范围结果

由最小二乘法拟合标准曲线产生的确定度为：

式中：S为标准偏差；Aj为对应峰面积；a为曲线截距；b为曲线斜率；cj为甜蜜素浓度点；n为测定次数；p为测定次数。

提取样品溶液，浓度分别为0.304 0 mg/mL 和0.291 9 mg/mL，即平均值为c=0.298 mg/mL，最小二乘法拟合标准曲线求样品浓度时产生的相对标准不确定度为=0.00544。

2.2.5 重复性引入的不确定度

（1）仪器重复性引入的不确定度。用混合均匀的同一个样品连续进样6 次，得出甜蜜素的含量分别为2.88 g/kg、2.83 g/kg、2.85 g/kg、2.84 g/kg、2.89 g/kg和2.86 g/kg，均值为2.86 g/kg。测量的重复性以标准偏差表示，此工程引入的相对标准不确度为：

（2）其他因素引入的不确定度。影响检测结果重复性的因素主要有人员操作、读数差异、测量仪器的变动性和样品不均匀等[5-6]。检验员用相同的一台仪器进样，对混匀的同一批次腌萝卜进行了6 次重复试验，甜蜜素含量分别为2.82 g/kg、2.90 g/kg、2.69 g/kg、2.78 g/kg、2.91 g/kg 和2.73 g/kg。 测量的重复性以标准偏差表示，。本次测量2=0.0892g/kg个样品，平均值为2.86 g/kg，本次测量的平均值的标准不确定度为=0.0631g/kg ，此过程的平均值的相对标准不确定度为：

重复性测量引入的合成相对不确定度为：

2.2.6 合成相对标准

由标准物质、样品称量、样品萃取和定容、最小二乘法拟合标准曲线求样品浓度以及重复性试验5个方面的操作引入的合成相对标准不确定度为：

2.2.7 相对扩展

置信概率为95%时，取包含因子k=2，则相对扩展不确定度为Urel=k×ucrel(W)=2×0.033 8=6.8%。

样品甜蜜素为2.86 g/kg,则其拓展不确定度U=2.86 g/kg×6.8%=0.19 g/kg。

3 结论

根据不确定度评估后，甜蜜素测定结果为2.86 g/kg，U=0.19 g/kg，k=2。由此得出，每个环节操作都对结果产生影响，所以应避免检验过程中人为造成的误差，提高检测结果的准确度。