食品中黄曲霉毒素B1 的荧光免疫分析技术检测分析

宋 姣

（新正检验检测有限公司，新疆乌鲁木齐 830000）

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是很多食品中的常见代谢产物，其致癌性和致畸性影响极为突出，因此国家有关部门对食品中的AFB1检测限量有着非常严格的要求。由此，针对AFB1的检测技术研究也在不断进行。目前，传统的液相色谱法、薄层色谱法和气相色谱法等技术已然难以满足实际需要，由此，荧光免疫分析技术应运而生，但这种技术尚处于初始发展阶段，其技术细节等还有待于进一步探究。

在本次食品AFB1荧光免疫分析工作中，主要应用免疫磁分离荧光检测法，对花生中的AFB1进行检测，这项技术主要使用磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）进行[1-2]。MNPs 材料具有更高的比表面积和更优的生物相容性，其在免疫化学反应完成后，会向反应体系中提供一个磁场，不同反应物因其电磁性质的差异，会在电磁力的作用下向着不同方向做定向运动，由此便实现了各种反应物的有效分离。在此过程中，食品样品内含有的AFB1会大量被抗体所捕获，而后使用近紫外波段光线对其进行照射，即可得到具有强荧光的衍生物，以此来实现对AFB1的精准分析[3-4]。目前，对于免疫磁分离荧光检测法的研究已经相对较多[5]。XIE 等[6]引入了“传感探针”技术，在MNPs 材料的基础上，以多孔C3N4 纳米薄片材料作为探针，再辅以离子迁移谱（Ion Mobility Spectroscopy，IMS）技术来实现对AFB1的检测，其检测效果较好，但其时间成本和资金成本偏高。为了克服高成本的缺陷，BECHEVA 等[7]研究人员在此基础上做进一步研究，将纳米薄片替换为牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）来进行检测，这种检测方法在时间和资金成本上大为降低，同时仍保持了较高的灵敏度和准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AFB1、AFB1-BSA 偶联物、荧光素5(6)-异硫氰酸酯、二甲基甲酰胺、G25 培养基、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇、AFB1抗体、牛血清白蛋白以及吐温80 等。同时本次研究使用花生材料为基础材料。

1.2 仪器与设备

SW-2 型荧光免疫层析定量检测仪、AFB1 荧光免疫层析定量检测卡、电子天平、旋涡混匀器、离心机、超纯水制备器和移液器。

1.3 实验方法

1.3.1 制备黄曲霉素-牛血清白蛋白-异硫氰酸酯荧光素偶联物

为制备此种偶联物，将一定量的AFB1-BSA 加入pH 值为9.6 的碳酸盐缓冲液中，再将适量的FITC溶于二甲基甲酰胺中待用。而后将二者混合于棕色试剂瓶中，于4 ℃下反应24 h，并使用G25 中性柱对其进行过滤，过滤完成后使用Tris 进行洗脱处理，得到AFB1-BSA-FITC 偶联物。

1.3.2 纳米磁性颗粒与抗体的固定化

在本实验中，MNPs 按照Gabrovska 研究团队[8]的制备方法进行制备，并使用氨丙基三乙氧基硅烷进行表面改性处理，确保MNPs 表面上的氨基与抗体中的氨基通过偶联作用相连接。而后基于以下几个步骤进行固定化处理：①在MNPs 修饰完成后，再使用戊二醛的磷酸盐缓冲液溶液对其进行活化，活化完成后，使用pH 值为7.2 的磷酸缓冲液（Phosphate Buffer，PB）进行洗涤；②将适量的AFB1抗体加入纳米粒子当中，将混合体系于4 ℃下反应24 h，再使用PB 进行3 次洗涤操作，并加入含有少量BSA和吐温80 的PB 溶液在摇床上反应1 h，反应完成后，再使用PB 溶液对反应体系洗涤4 次；③将已基本固定化的MNPs 和AFB1抗体重新悬浮于PB 溶液中，调整固定化产物的终浓度至5 mg/mL。

在固定化步骤完成后，还需要对固定化后的AFB1抗体的活性进行检测。在该环节中，使用聚苯乙烯微效板，将固定化后的AFB1抗体放置其上，对其进行非特异性吸附。具体的抗体吸附量则通过Bradford 法（100 μg）进行测定，AFB1抗体的数量则与MNPs 的数量等同。在以上条件准备就绪后，设定AFB1-BSA-FITC 荧光共轭物质的浓度梯度分别为30 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，以此来进行固定化后的AFB1的抗体活性之测定。

1.3.3 样品前处理

选取适量的花生材料，对其进行充分研磨、过筛，得到花生粉。而后准备4 个容器，其中3 个容器为实验组，放置等量的花生粉样品，另一个容器为对照组，放置甲醇溶液。在实验组中，分别加入溶于甲醇的AFB1，使之分别达到0.4 ng/g、1.0 ng/g、2.0 ng/g 的浓度水平。花生样品均在室温条件下干燥过夜，并使用浓度为80%的甲醇溶液进行提取。①制备适量的MNP-Ab，并等分为4 份，分别放置于4个瓶子中待用；②加入适量的花生AFB1稀释提取物，混合为悬浊液后，再将该悬浊液在37 ℃条件下于摇床中反应15 min；③在反应后的混合物中加入适量的AFB1-BSA-FITC 偶联物，仍在37 ℃条件下于摇床中反应15 min，而后对上清液的荧光强度进行测定。

1.4 对MNPs 用量与荧光共轭浓度进行优化

为实现MNPs 用量与荧光共轭浓度的优化，在本次实验中，设定3个不同的MNPs用量，为0.125 mg、0.250 mg、0.375 mg，并使用PB 的甲醇溶液进行稀释。具体的分析步骤如下：①将浓度分别为0.25 pg/mL、1.00 pg/mL、12.50 pg/mL、50.00 pg/mL和100.00 pg/mL的AFB1样品等量加入到含有MNPs 的容器中，在37 ℃条件下于摇床中反应15 min；②每个样品中均加入等量的AFB1-BSA-FITC 荧光偶联物，继续在37 ℃条件下于摇床中反应15 min；③使用磁力分离器对AFB1的MNPs 和AFB1-BSA-FITC 分别进行收集，测定上层清液中过量的AFB1-BSA-FITC 荧光强度，此数值即可用来描述AFB1与MNPs 的结合情况。

2 结果与分析

2.1 MNPs 的最佳用量

对于给定浓度的目标抗原（即AFB1），均有一个最合理的MNPs 浓度与之对应，当AFB1浓度不同时，3 种不同数量的MNPs 中所获得的归一化信号如表1 所示。

表1 不同浓度梯度的AFB1 的归一化信号情况

从表1 中的数据可以得知，MNPs 的最佳用量为0.250 mg，在这种前置条件下，上清液中过量的AFB1-BSA-FITC 荧光强度维持在相对偏高的状态，在AFB1的不同浓度梯度下，荧光强度值的变化梯度也最为明显。因此MNP 设置为0.250 mg 时，本次荧光免疫分析技术有着最为准确的分析效果。

2.2 荧光共轭物最佳浓度的确定

为确保在不同抗原浓度下的荧光信号均能准确分辨，因此对不同AFB1浓度和不同AFB1-BSAFITC 共轭浓度下的荧光归一化信号进行分析，结果发现，当AFB1-BSA-FITC的共轭浓度为28 μg/mL时，荧光信号的强度和分辨率均可最大限度上满足要求，信号归一化后可得到证实。因此，此共轭浓度为最佳的AFB1-BSA-FITC 共轭浓度，能够确保本次建立的荧光免疫分析技术的分辨率和准确性。

2.3 花生样品中AFB1 的测定情况

在前文的3 个实验组中，均对其进行提取程序，并在提取程序完成后对提取液进行稀释，以此来计算RSD 和回收率，计算结果如表2 所示。

从表2 中的数据可以看出，花生样品中的回收率相对较高。同时，在不提取情况下，检测工作均可在35 min 内完成，同时获得的LOD 指标参数为0.9 mg/mL，已经处于足够低的水平，由此可知，本次所建立的食品中AFB1的荧光免疫分析技术能够用于实际样品中AFB1的检测，同时这种方法在没有非特异性干扰的前提下，能够对较低浓度的毒素进行较为准确的测定，检测的线性范围在0.25 ～100 pg/mL。

表2 各组花生样品中的AFB1 检测结果及回收率（n=3）

3 结论

本次研究工作中，以检测花生样品中的AFB1为实际案例，建立了一种灵敏度和检测效率均较高的基于MNPs 的荧光免疫分析技术方法，该方法具有较宽的检测线性范围和较低的LOD 免疫检测值，且获得的免疫测定时间也位于35 min 以下。显然，这种荧光免疫分析技术方法相较于传统方法而言，在检测的时间成本上优势较为突出，预计其在今后的食品AFB1含量检测中有着潜在的应用价值，有必要进一步深入探究和优化。