盐胁迫下褪黑素对小麦种子萌发和幼苗生理特性的影响

刘佳奇,李 丽,杨红红,孙 敏,冯汉青，2

(1. 西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070；2. 西北师范大学新农村发展研究院，甘肃兰州 730070)

据联合国粮食安全署报告，世界上盐渍化的土地面积约8.31×10hm，而我国盐渍化土地有约3.6×10hm，主要分布在西北、东北和华北的干旱、半干旱地区。小麦是世界范围内广泛种植的粮食作物之一，在我国常年种植面积和产量约占我国粮食总面积和总产量的25%和22%左右，小麦产量与我国粮食安全息息相关。相关研究表明，土壤中的盐能够影响种子萌发，引起植物体生理功能紊乱，导致植物幼苗生长减缓；损害叶绿体结构，使叶绿素含量和气孔导度降低，造成植物光合效率和蒸腾作用下降，最终造成小麦减产。因此，寻找增强小麦的耐盐性方法，对其增产、增收具有重要意义。

褪黑素(melatonin，MT)是一种在动植物中广泛存在的小分子物质，为色氨酸吲哚类衍生物，具有很强的抗氧化作用，能促进植物侧根的生长，延缓叶片衰老。褪黑素可通过增强抗氧化作用等途径增强植物对干旱、盐害、重金属、高温、冷害等多种逆境的抗性。研究表明，外源褪黑素能够调节番茄的种子萌发和生长发育；缓解干旱胁迫对番茄幼苗光合性能的抑制，加强光合运转效率；显著缓解硝基苯酚胁迫对水稻幼苗生长、叶片PS Ⅱ光化学效率等产生的影响，提高水稻幼苗对硝基苯酚胁迫的适应性。有关外源褪黑素对小麦耐盐胁迫的效应鲜见报道。

本试验拟分析盐胁迫对小麦种子萌发系数、幼根干重、鲜重、根长和幼根细胞死亡水平等指标的影响，探究在盐胁迫下施用不同浓度褪黑素对小麦种子萌发和幼苗生理特性的效应，为盐碱地小麦的栽培提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为春小麦绵杂麦168。

1.2 试验设计

培养液设置7个处理，分别为蒸馏水(CK)，100 mmol·LNaCl溶液(T)，T+5 μmol·L褪黑素溶液(T5)，T+50 μmol·L褪黑素溶液(T50)，T+100 μmol·L褪黑素溶液(T100)，T+150 μmol·L褪黑素溶液(T150)，T+250 μmol·L褪黑素溶液(T250)。选取大小均匀、颗粒饱满的小麦种子，用0.1%的次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水冲洗3～4次；在培养皿底部铺垫用以上处理液充分浸湿的双层滤纸，每皿均匀摆放已消毒的100粒小麦种子，每个处理重复4次；于恒温培养箱中进行种子萌发和幼苗试验，温度为25 ℃，光照周期为 16 h光照/8 h黑暗，相对湿度70%。每日补充相应处理溶液以保持培养皿中滤纸的湿度。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 种子萌发指标测定

培养2 d后开始统计小麦的发芽种子数(以胚根为种子长度的二倍左右为发芽标准)，每天统计一次，到第6 d为止。计算发芽率、发芽势和相对耐盐指数。

发芽势=(日发芽种子数/供试种子数)×100%；

发芽率=(6 d发芽种子数/供试种子数)×100%；

相对耐盐指数=(处理组发芽率/对照组发芽率)×100%。

1.3.2 幼苗生长指标测定

取培养4 d的小麦6株，用蒸馏水冲洗3～4次幼根；用吸水纸将表面水分吸干；测量小麦幼根和胚芽鞘长度；将幼苗分为根和地上部并分别称鲜重；将其放入70 ℃的烘箱中24 h，烘干并称重。重复4次。

1.3.3 叶绿素荧光参数和叶绿素含量的测定

将培养7 d的小麦幼苗取出。参照Flexas等和Hazrati等的方法，使用叶绿素荧光成像仪(ImagePAM)测定小麦幼苗的叶绿素荧光参数。具体测定步骤如下：连接仪器，仪器正常运行后测得暗适应状态的初始荧光()和最大荧光()，当所测材料在作用光下的实时荧光(Fs)达到稳态(20 s)后打开饱和脉冲光，测得最大荧光(')，再打开远红外光，测最小荧光(')。测量结束后导出参数(光化学淬灭系数)、ETR(PS Ⅱ光合电子传递速率)、NPQ和(非光化学淬灭系数)，并计算/(PS Ⅱ最大光化学量子产量)。

取培养7 d的小麦叶片，剪碎，放入研钵中，加入3 mL 80%( V/V) 的丙酮，研成匀浆，倒入5 mL离心管中，离心后，于 663 nm 和 645 nm 下测定吸光值，计算叶绿素含量。

1.3.4 根细胞死亡水平测定

根据Hung等的方法进行。将培养4 d的小麦幼根用蒸馏水清洗3～4次，室温下浸泡于0.25%的伊文思蓝染液中15 min；用蒸馏水反复清洗表面的伊文思蓝染液至去除表面染料；将幼根切碎，放入5 mL 50%的甲醇和1%十二烷基磺酸钠(SDS)的混合提取液中，50 ℃水浴1 h；检测提取液在595 nm处的吸光值，以此来代表细胞死亡程度。

1.4 数据处理

采用Excel 2019和SPSS 25.0对数据进行统计和作图；采用ANOVA和Duncan法进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对盐胁迫小麦萌发指标的影响

由图1可见，盐胁迫(T)下，小麦种子的发芽势、发芽率和发芽期相对耐盐指数均较CK显著降低。施用褪黑素可在不同程度上提高盐胁迫下小麦种子萌发指标，T100处理的发芽势、发芽率和发芽期相对耐盐指数较T处理显著提高，分别提高了35.8%、7.8%、7.8%；表明添加100 μmol·L褪黑素能够有效缓解盐胁迫对小麦种子萌发的抑制作用。

图柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 褪黑素对盐胁迫小麦幼苗生长指标的影响

由图2可知，在100 mmol·LNaCl胁迫(T)下，小麦幼苗的生长受到了明显的抑制，与CK相比，小麦的根长、胚芽鞘长、根的鲜重和干重均显著降低。

与T处理相比，T5、T50、T100、T150处理的小麦根长显著增加，分别增加了37.5%、33.8%、54.2%、61.7%，T250与T处理无显著差异(图2A)；T5、T50、T100、T150处理的胚芽鞘长显著增加，分别增加了22.4%、25.7%、36.5%、 42.8%、21.7%(图2B)。褪黑素浓度为150 μmol·L时对盐胁迫引起的小麦根长和胚芽鞘抑制作用的缓解效果最佳。

与T处理组相比，T5、T50、T100、T150、T250处理根鲜重分别增加了41.1%、40.7%、77.4%、69.7%、19.3%(图2C)；根干重分别增加了40.9%、47.3%、54.3%、60.2%、32.6%(图2D)，差异均显著。褪黑素浓度为100～150 μmol·L对盐胁迫引起的小麦根鲜重和干重抑制作用的缓解程度最明显。

从图2E可以看出，与T处理相比，T5、T50、T100、T150、T250处理地上部干重分别增加了46.7%、47.3%、55.8%、48.9%、44.8%，差异均显著。褪黑素浓度为100 μmol·L对盐胁迫导致的小麦地上部干重抑制的缓解作用最显著。

图2 褪黑素对小麦幼苗生长的影响

2.3 褪黑素对盐胁迫下叶片叶绿素荧光参数的影响

由图3A、3B可以看出，相较于CK，100 mmol·LNaCl处理下小麦幼苗叶片和ETR显著降低，分别减小了52.3%和35.4%。相较于T处理，T5、T50、T100、T150、T250处理的值分别增加29.1%、30.5%、47.4%、 48.1%和43.8%，ETR值分别增加13.3%、 22.7%、27.7%、28.9%和21.2%。结果表明，褪黑素能显著缓解盐胁迫下小麦幼苗叶片和ETR的下降，浓度为100～250 μmol·L时效果最好。

光化学淬灭系数和非光化学淬灭系数存在此消彼长的相互竞争关系。由图3C、3D可以看出，在NaCl处理下，伴随着小麦幼苗叶片的降低，NPQ和显著升高。相较于T处理，加入5、50、100、150、250 μmol·L褪黑素均使NPQ和显著降低。由图3E可以看出，相较于CK，T处理下，小麦幼苗叶片/显著降低，相较于T处理，加入不同浓度褪黑素后均使得小麦幼苗叶片的/显著升高。

图3 褪黑素对小麦幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

2.4 褪黑素对盐胁迫下叶片叶绿素含量的影响

由图4可知，相较于CK，T处理下小麦幼苗叶片的叶绿素含量显著下降(16.5%)。T150处理叶绿素含量较T处理提高了10.7%，表明添加150 μmol·L褪黑素可显著促进盐胁迫下叶绿素的合成，其他浓度对叶绿素合成的促进作用不显著。

图4 褪黑素对小麦幼苗叶片叶绿素含量的影响

2.5 盐胁迫下褪黑素对小麦幼根细胞死亡的 影响

如图5所示，与CK相比，T处理下小麦幼根细胞死亡水平显著升高(36.2%)。与T处理相比，T100、T150和T250处理后根细胞死亡水平显著降低，分别降低9.2%、7.0%和11.4%，T5和T50处理相较T处理无显著差异。结果表明，外源褪黑素在100～250 μmol·L时能够有效缓解盐胁迫对小麦幼根细胞的损伤。

图5 褪黑素对小麦幼根细胞死亡的影响

3 讨 论

种子萌发是植物能够生长的首要条件。本研究结果表明，100 mmol·LNaCl处理对小麦种子的萌发具有明显的抑制作用，而适宜浓度的褪黑素对盐胁迫下小麦种子的萌发具有一定缓解作用。这与张 娜等发现的在盐胁迫下施加褪黑素能够显著提高狼尾草种子的发芽势和发芽率的报道的结果一致。褪黑素的这种作用可能与褪黑素能够解除盐胁迫对种子萌发过程中的关键酶和渗透性物质的抑制作用有关，但具体机制有待进一步研究。

生物量是植物在逆境环境下生长发育的关键指标。施加褪黑素能够使小麦苗期生物量相关指标得以升高。这与在燕麦以及在扁穗雀麦中的研究结果一致。植物生长过程中的物质积累主要是通过光合作用以及根系对营养物质的吸收。盐胁迫通过影响光合及根系细胞活力而抑制植物的生长。因此，研究褪黑素对盐胁迫下植物光合和细胞活力的效应有重要 意义。

PS Ⅱ是逆境胁迫下光合机构受到损伤的原初位点之一，其光化学水平的变化代表着逆境中植物光合作用的变化。而叶绿素荧光参数作为反映PS Ⅱ光化学活性的灵敏探针，能够准确的反应逆境对PS Ⅱ的影响。本研究发现，100 mmol·LNaCl处理下，小麦叶片、ETR和/显著下降，和NPQ显著升高，表明在盐胁迫下小麦叶片光合电子传递受阻，对光能的吸收和运行效率降低，光合色素将光能转化为化学能的能力降低，以非辐射形式损耗的能量增加；而加入褪黑素能够显著缓解、ETR和/的下降、和NPQ的升高，这表明褪黑素能够维持盐胁迫下PS Ⅱ的光化学活性，促进PS Ⅱ将光能转变成化学能，进而有效的缓解盐胁迫对PS Ⅱ的抑制作用，提高小麦的耐盐性。这与王芳等发现外源褪黑素能够改善盐胁迫下玉米幼苗的光合作用相一致。

在一定程度上叶绿素含量直接反应光合作用的强弱。大量研究表明，NaCl胁迫对植物生长和生理特性产生负面影响，导致浅绿色症状，幼苗生长发育迟缓，损伤叶绿体的超微结构，叶绿素含量降低，而且盐胁迫后叶绿体会产生大量的ROS，使叶绿体蛋白合成受阻，从而影响叶绿体的发育和光合作用。本研究发现，褪黑素浓度150 μmol·L时显著缓解了NaCl处理下叶绿素含量的降低。推测这是由于褪黑素促进叶片光合作用所致，叶绿素荧光参数的改变可能与叶绿素含量变化密切相关。100 mmol·LNaCl能够显著地损伤小麦幼根细胞，而褪黑素浓度达到100 μmol·L以上时能够显著缓解盐胁迫对小麦幼根细胞的损伤，提示了褪黑素能够保护小麦的幼根细胞。Liang等研究也表明，褪黑素能够有效减轻细胞损伤，从而延缓水稻叶片损伤，提高水稻的耐盐性。

在小麦幼苗生长过程中，根系是最先接触到盐胁迫的器官，盐胁迫导致小麦幼根细胞死亡水平上升，影响小麦幼苗对水分和物质的吸收和运输能力。随着过多的盐离子进入到小麦叶片中，光化学反应也受到抑制，进而减少在植物进行光合作用的能力，导致小麦的生长和物质积累受到了抑制。研究表明，褪黑素具有延阻细胞死亡、调节离子平衡、调控多种抗盐相关基因表达的功能。推测褪黑素可能通过多种方式降低了盐胁迫对于小麦生长、叶绿素合成、光合和细胞活力的不利影响，提高了小麦对于盐胁迫的抗性。

综上，100 mmol·LNaCl胁迫会显著抑制小麦种子萌发和幼苗生长，降低小麦叶片叶绿素含量和光合效率，损伤幼根细胞；适宜浓度的褪黑素处理可有效缓解盐胁迫对小麦生长抑制和细胞损伤程度，以100～150 μmol·L褪黑素的缓解效果最为明显。因此，施加外源褪黑素有望成为缓解盐胁迫对小麦不利影响的有效方法，但其具体作用机制还需进一步研究。