卵巢癌组织中miR-431-5p、驱动蛋白超家族成员11的表达水平及临床意义▲

崔 楠 花仲首 朱小丹 樊 磊

(本溪市中心医院妇产科，辽宁省本溪市 117000)

卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，据统计，2020年全球新增卵巢癌病例31.4万例，死亡20.7万例，发病率和病死率均居女性恶性肿瘤第8位，5年存活率仅为25%～50%[1-2]。卵巢癌是一种异质性疾病，其发病机制尚未完全明确，因此了解卵巢癌的发病机制、改善患者预后、延长生存时间，已成为目前的研究热点之一。肿瘤的发生和发展由多种因素、基因介导，miRNA是一类非编码小RNA，可通过调控癌基因与抑癌基因参与肿瘤的发生，以及细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为[3]。研究显示，miR-431-5p作为抑癌基因，参与抑制结肠癌、舌鳞状细胞癌等恶性肿瘤的增殖、迁移、侵袭[4-5]。驱动蛋白家族成员11(kinesin family member 11，KIF11)为细胞分裂驱动蛋白家族一员，参与细胞增殖、胞质分裂、染色体分离、纺锤体分裂等过程，其过表达可引起细胞分裂异常，与肿瘤的发生和发展密切相关[6-8]。目前尚未明确miR-431-5p、KIF11与卵巢癌的关系，故本研究探讨卵巢癌组织中miR-431-5p、KIF11的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系，以期为卵巢癌的诊断和治疗提供一种新的策略。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月至2016年3月我院收治的113例接受根治性或姑息性切除术治疗的卵巢癌患者，年龄32～84(58.14±8.36)岁；病理类型为浆液性囊腺癌62例，黏液性囊腺癌36例，子宫内膜样癌15例；肿瘤直径≥3 cm共52例，<3 cm共61例；低分化43例，中高分化70例；国际妇产科学联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期[9]为Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期35例；26例患者发生淋巴结转移。纳入标准：(1)经术后病理检查确诊为卵巢癌；(2)初次确诊，术前未接受过任何内分泌治疗或放化疗；(3)临床资料完整；(4)患者及家属均对本研究知情同意；(5)可接受并完成随访者。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤者；(2)合并严重心、肝、肾等脏器疾病者；(3)合并血液系统疾病者；(4)合并全身感染性疾病者；(5)妊娠期及哺乳期妇女。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 miR-431-5p和KIF11的检测方法 取手术切除的部分癌组织和癌旁组织(距离癌组织>5 cm)，液氮预冷后剪碎并反复研磨，使用TRIzol总RNA提取试剂盒(无锡百泰克生物技术有限公司，货号：RP2401)提取卵巢癌组织和癌旁组织中的总RNA，分别采用紫外分光光度计、凝胶电泳检测RNA浓度和纯度、完整性。使用反转录试剂盒(上海红荣微再生物工程技术有限公司，货号：RR036A)合成cDNA后，进行实时荧光定量PCR反应。miR-431-5p正向引物序列为5′-TGTCTTGCAGGCCGTCATG-3′，反向引物序列为5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；KIF11正向引物序列为5′-CAGAUUGAUGUUUACCGAATT-3′，反向引物序列为5′-GAAACUUACUGAUAAUGGUTT-3′。实时荧光定量PCR反应体系包括12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2 μL cDNA模板、8.5 μL RNase-free H2O。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，循环40次。分别以U6(正向引物序列为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′)、GAPDH(正向引物序列为5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，反向引物序列：5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′)作为内参，采用2-ΔΔCt法计算组织中miR-431-5p、KIF11的相对表达水平。

1.3 随访 在患者出院后，采用门诊或电话方式对其随访5年，随访截止日期为2021年3月，统计术后5年总生存率，生存时间定义为术后至癌性死亡。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用SNK-q检验；采用Pearson检验分析指标间的相关性；采用Kaplan-Meier曲线绘制生存率，组间生存率比较采用log-rank检验；采用Cox回归模型分析卵巢癌患者预后不良的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢癌组织和癌旁组织中miR-431-5p、KIF11 mRNA表达水平的比较 卵巢癌组织中miR-431-5p的表达水平低于癌旁组织，KIF11 mRNA的表达水平高于癌旁组织(均P<0.05)。见表1。

表1 卵巢癌组织和癌旁组织中miR-431-5p和KIF11 mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.2 卵巢癌组织中miR-431-5p与KIF11 mRNA表达水平的相关性 卵巢癌组织中miR-431-5p表达水平与KIF11 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.453，P<0.001)。

2.3 卵巢癌组织中miR-431-5p、KIF11 mRNA表达水平与卵巢癌患者临床病理特征的关系 与FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者相比，FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者卵巢癌组织中的miR-431-5p表达水平更低，KIF11 mRNA表达水平更高(均P<0.05)；与无淋巴结转移的患者相比，淋巴结转移的患者卵巢癌组织中的miR-431-5p表达水平更低，KIF11 mRNA表达水平更高(均P<0.05)；不同年龄、绝经状态、病理类型、肿瘤直径、肿瘤组织分化程度的患者之间miR-431-5p和KIF11 mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 卵巢癌组织中miR-431-5p、KIF11 mRNA的表达水平与卵巢癌患者临床病理特征的关系(x±s)

2.4 卵巢癌组织中miR-431-5p、KIF11 mRNA表达水平与卵巢癌患者预后的关系 本组病例共随访3～60个月，中位随访时间为38个月，失访9例，总生存率为53.98%，见图1。Kaplan-Meier曲线分析显示，miR-431-5p表达水平≥0.49的患者(n=58)术后5年总生存率为65.52%，高于miR-431-5p表达水平<0.49的患者(n=55)的41.82%(χ2=7.557，P=0.006)；KIF11 mRNA表达水平≥1.70的患者(n=59)术后5年总生存率为40.68%，低于KIF11 mRNA表达水平<1.70的患者(n=54)的68.52%(χ2=9.903，P=0.002)。见图2。

图1 卵巢癌患者生存曲线

图2 不同miR-431-5p、KIF11 mRNA表达水平的卵巢癌患者的生存曲线

2.5 卵巢癌患者预后不良影响因素的Cox回归分析 以年龄(≥50岁=1，<50岁=0)、绝经情况(是=1，否=0)、病理类型(浆液性囊腺癌=1，黏液性囊腺癌=2，子宫内膜样癌=3)、肿瘤直径(≥3 cm=1，<3 cm=0)、分化程度(低分化=1，中高分化=0)、FIGO分期(Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)、淋巴结转移(有=1，无=0)、miR-431-5p表达水平(≥0.49=1，<0.49=0)、KIF11 mRNA表达水平(≥1.70=1，<1.70=0)为自变量，卵巢癌患者的预后(死亡=1，存活=0)为因变量，纳入多因素Cox回归模型。结果显示，FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、KIF11 mRNA表达水平≥1.70为卵巢癌患者预后不良的独立危险因素，miR-431-5p表达水平≥0.49为独立保护因素(均P<0.05)。见表3。

表3 卵巢癌患者预后不良影响因素的多因素Cox回归分析结果

3 讨 论

卵巢癌是一种病死率极高的妇科肿瘤，目前的治疗方法仍以手术切除为主，化放疗为辅。但大多数患者通常忽略腹围增加、盆腔或腹部疼痛、腹胀等细微症状和体征，70%的卵巢癌患者确诊时肿瘤分期已达Ⅲ～Ⅳ期，伴盆腔播散或淋巴转移，错过最佳治疗时机，存活率较低[10]。虽然近年来靶向治疗和免疫治疗的发展极大地延长了卵巢癌患者的生存期，但还是无法达到治愈的效果，且耐药现象愈发严重[11]。因此还需要从分子层面进一步深入研究其发生机制，识别更多的治疗靶点。

编码基因一直是肿瘤学领域的研究热点，人体中95%以上的编码基因可被转录为非编码RNA，后者为无需编码蛋白质的RNA，在RNA水平就可发挥生物学作用。miRNA是一种内源性非编码小RNA，能在转录后水平上靶向mRNA的3′非翻译端，降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译，参与调节细胞生长、增殖和凋亡等过程[3]。研究表明，某些miRNA可同时调控多种促癌基因或抑癌基因的表达，参与卵巢癌的发生、侵袭、转移或耐药，与卵巢癌患者预后密切相关[12-14]。miR-431-5p位于人类染色体14q32上，作为一种与血压相关的miRNA，其已被证实为参与高血压、血管损伤的关键调节因子[15]。Sun等[16]的研究显示，miR-431-5p能通过靶向Pannexin 3从而抑制骨肉瘤的发生。Kong等[17]研究报告，miR-431-5p可靶向调控UROC28基因来抑制肝细胞癌细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示，卵巢癌组织中miR-431-5p的表达水平低于癌旁组织，FIGO分期更高或淋巴结转移的患者卵巢癌组织中miR-431-5p的表达水平更低(均P<0.05)，说明miR-431-5p可能在卵巢癌中发挥抑癌基因的作用。Cox回归分析显示，miR-431-5p表达水平≥0.49的患者术后5年总生存率更高，为卵巢癌患者预后不良的独立保护因素(P<0.05)，说明miR-431-5p低表达参与了卵巢癌患者预后不良的发生。Zhu等[18]将miR-431-5p转染至卵巢癌细胞(卵巢上皮癌细胞系CAOV-3、OVCAR-3)后发现，癌细胞的增殖、迁移能力显著降低，凋亡率显著增加，这进一步佐证了本研究的结果。

有丝分裂为真核生物进行细胞分裂的主要方式，细胞分裂时会复制自身DNA以确保子代细胞DNA完整，若该过程中DNA损伤或复制不完整，则会引起癌症等疾病的发生[19]。驱动蛋白在细胞分裂过程中发挥重要作用，其中胞质分裂、染色体排列及纺锤体双极性建立，均依赖于驱动蛋白的协同作用[20]。KIF11又称为驱动蛋白Eg5，位于人类染色体10q24.1上，研究表明，其活性受到抑制或表达缺失可促进单极纺锤体的形成，阻断细胞分裂过程，过表达则会引起基因组不稳定，导致细胞分裂异常，与肿瘤的发生密切相关[21-22]。KIF11在肝细胞癌、乳腺癌中均表达上调，与癌症的发生和预后不良相关[23-24]。本研究结果显示，卵巢癌组织中KIF11 mRNA的表达水平高于癌旁组织，FIGO分期更高或淋巴结转移的患者卵巢癌组织中KIF11 mRNA的表达水平更高(P<0.05)，说明KIF11可能在卵巢癌中发挥促癌基因的作用。Cox回归分析显示，KIF11 mRNA表达水平≥1.70的患者的术后5年总生存率降低，为卵巢癌患者预后不良独立危险因素(P<0.05)，说明KIF11高表达参与了卵巢癌患者预后不良的发生。通过miRNA靶基因预测数据库TargetScan分析发现，KIF11与miR-431-5p的3′非翻译端存在潜在结合位点[25]。本研究结果也显示，卵巢癌组织中miR-431-5p表达水平与KIF11 mRNA表达水平呈负相关(P<0.05)，说明二者可能共同影响卵巢癌患者的预后。张洪涛等[25]发现，在卵巢癌细胞中上调miR-431-5p或敲低KIF11可抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭，双荧光素酶基因报告证实miR-431-5p能负向调控KIF11的表达。上述研究进一步佐证了本研究的结果。

综上所述，卵巢癌组织中miR-431-5p表达下调，KIF11表达上调，二者均与卵巢癌的发生和发展有关，可能共同影响卵巢癌患者的预后。但本研究为单中心研究，且关于miR-431-5p、KIF11对卵巢癌的影响机制尚不完全明确，还需进一步深入研究。