顶空气相色谱法测定睾酮中的残留溶剂

侯海波，郑建雄，李 廿，朱保林

（湖北竹溪人福药业有限责任公司，湖北 十堰 442300）

睾酮是由男性的睾丸或女性的卵巢分泌的一种天然雄激素，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用[1-2]。睾酮能影响多种身体机能及代谢，包括血生成、体内钙平衡、骨矿化作用、脂代谢、糖代谢等，同时睾酮还是合成丙酸睾酮、十一酸睾酮等甾体药物的重要医药中间体[3-4]。睾酮在生产合成过程中使用的二类有机溶剂有甲醇、吡啶，三类有机溶剂有乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯。本研究按照ICH关于残留有机溶剂指导原则的要求[5-6]，建立顶空气相色谱法测定睾酮中有机溶剂残留量，并对该分析方法进行验证[7-8]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 7890B气相色谱仪（配备FID检测器，7697A顶空进样器及OpenLAB CDS工作站，美国Agilent公司）；ME204E型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。

1.2 试剂

睾酮（湖北竹溪人福药业有限责任公司，批号：180601，180602，180603）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，色谱纯，Merck公司）；甲醇，乙醇（分析纯，国药集团）；甲酸乙酯，乙酸乙酯，吡啶（分析纯，上海凌峰）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-624型（30 m×0.53 mm，3.0 μm）毛细管柱；升温程序：35 ℃保持10 min，然后以6 ℃/min的速率升温至120 ℃，再以20 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持2 min；检测器温度250 ℃；进样口温度220 ℃；分流比10:1；载气为氮气，载气流速2.0 ml/min；顶空进样，顶空平衡温度100 ℃，平衡时间45 min；定量管温度110 ℃；传输线温度120 ℃；进样体积1000 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 定位溶液制备 精密称取甲醇3.0 g，乙醇5.0 g，甲酸乙酯5.0 g，乙酸乙酯5.0 g，吡啶0.2 g，分别置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中，以DMF稀释至刻度，摇匀；分别取上述溶液5 ml，置于不同100 ml量瓶中，以DMF稀释至刻度，混匀；再分别取上述溶液1.0 ml，置于不同10 ml顶空瓶中，再加DMF2.0 ml，密封，混匀。

2.2.2 对照品贮备溶液制备 精密称取甲醇3.0 g，乙醇5.0 g，甲酸乙酯5.0 g，乙酸乙酯5.0 g，吡啶0.2 g，置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中，以DMF稀释至刻度，混匀；再移取上述溶液5 ml，置100 ml量瓶中，以DMF稀释至刻度，混匀。

2.2.3 对照品溶液制备 取对照品贮备溶液1.0 ml于10 ml顶空瓶中，加DMF 2.0 ml，密封，混匀。

2.2.4 供试品溶液制备 精密称取睾酮0.5 g，置于10 ml顶空瓶中，加入DMF 3 ml，密封。

2.2.5 样品加标溶液制备 精密称取睾酮0.5 g，置于10 ml顶空瓶中，加入对照品贮备溶液1.0 ml及DMF 2.0 ml，密封。

2.3 专属性实验

取DMF 3.0 ml，置10 ml顶空瓶中，密封，作为空白溶液；取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、样品加标溶液，按2.1项下色谱条件分别进样，结果表明加入睾酮后没有其他杂质峰出现，睾酮在此体系中稳定，不与溶剂反应，见图1。各溶剂的分离度良好，可满足实验要求。见表1。

图1 专属性实验色谱图

表1 溶剂保留时间及分离度

2.4 重复性

取6份样品加标溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定。甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的含量RSD分别为1.25 %，1.51 %，1.78 %，1.92 %，1.52 %。结果表明，该色谱条件下重复性良好。

2.5 检测限

信噪比（S/N）约为3时的溶液浓度为各溶剂的检测限，甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的检测限分别为1.67，3.67，0.66，0.42，0.04 μg/ml。

2.6 定量限

信噪比（S/N）约为10时的溶液浓度为各溶剂的定量限，甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的定量限分别为5.0，11.2，2.1，1.25，0.13 μg/ml。

2.7 线性试验

取定量限溶液和0.4，0.8，1.0，1.2 ml对照品溶液各3份，分别置于15个不同顶空瓶中，并加DMF溶液至3 ml，密封，摇匀，按2.1项下色谱条件分别进样测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归，得回归方程，见表2。结果表明，各溶剂在相应的浓度范围内线性关系良好。

表2 溶剂线性方程及相关系数

2.8 加样回收试验

取已知含量的同一批样品，精密称取9份，每份0.5 g，置于10 ml顶空瓶中。分为3组，分别加入对照品贮备溶液0.8 ml（80 %浓度水平）、1.0 ml（100 %浓度水平）、1.2 ml（120 %浓度水平），再分别加入DMF溶液2 ml，密封，混匀，计算80 %，100 %及120 %浓度水平下各组分的回收率，结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.9 耐用性实验

取12份样品加标溶液，平均分为6组，分别在正常条件、载气流速1.8 ml/min、载气流速2.2 ml/min、起始柱温30 ℃、起始柱温40 ℃和更换不同型号色谱柱[ZB-624型（30 m×0.32 mm，1.8 μm）毛细管色谱柱]条件下进样，计算各溶剂峰面积的RSD。结果，更换色谱柱后各溶剂未能检出，正常条件、载气流速1.8 ml/min、载气流速2.2 ml/min、起始柱温30 ℃、起始柱温40 ℃条件下甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶峰面积的RSD分别为2.00 %，2.22 %，2.52 %，2.82 %，2.73 %，结果表明在特定色谱柱条件下耐用性良好。

2.10 样品测定

取3批样品（批号：180601，180602，180603）依法测定，结果见表4。溶剂限度为：甲醇：≤3000 ppm；乙醇：≤5000 ppm；甲酸乙酯：≤5000 ppm；乙酸乙酯：≤5000 ppm；吡啶：≤200 ppm。结果表明各溶剂残留量均符合限度要求。

表4 3批样品中残留溶剂检测结果

3 结论

本文建立顶空气相色谱测定睾酮中甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶残留溶剂的方法并进行验证。结果表明，该分析方法能有效分离甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶，且操作简便、重复性好、灵敏度高、适用性强、结果准确，适用于睾酮的残留溶剂检测。该方法同样适用于生产工艺中使用甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶的其他甾体原料药的残留溶剂的检测。