生长激素释放激素受体拮抗剂对翼状胬肉上皮细胞生长的影响及机制△

何倍婷 林宏亮 王 盛 覃泳杰 张洪洋

翼状胬肉作为一种常见的良性增生性眼表疾病，常表现为鼻侧结膜和纤维血管组织呈三角形增生，当过度生长时会引起严重的角膜散光，甚至直接侵犯瞳孔区导致视力障碍。翼状胬肉患病率高，但成因尚不明确，其治疗方法以手术切除为主，只是术后复发率高。因此，研究翼状胬肉的发病机制，探索可能有效的药物治疗方法，对翼状胬肉的防治具有重要意义。有研究发现，翼状胬肉发病早期近角膜缘上皮细胞表达基质金属蛋白酶(MMPs)，MMPs 具有溶解角膜前弹力层的作用，致使翼状胬肉上皮细胞(PECs)向角膜移行和侵蚀[1-2]。因此，如何抑制PECs的增殖，促使其凋亡，是治疗翼状胬肉的关键。我们早期研究发现，生长激素释放激素受体(GHRH-R)在翼状胬肉上皮组织中异常高表达，提示GHRH-R是PECs增殖和侵袭的潜在重要因素[1-2]。本研究通过使用GHRH-R拮抗剂MIA602进一步探索GHRH-R对翼状胬肉生长的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco,美国)，MIA602(AVS实验室提供，美国)，单克隆抗体GHRH-R(ab76263)、Caspase-3(ab32042)、p-ERK1/2(ab201015)(Abcam,美国)，内参GAPDH(#8884,CST,美国)，FITC标记IgG荧光二抗(Cambridge,美国)，DAPI染料(含封片剂)(Sigma,美国)。荧光倒置显微镜(蔡司，德国)，直流稳压电泳仪(Bio-Rad,美国)。

1.1.2 样本取材结膜下人Tenon囊组织取自2019年7月至2021年6月于广东省人民医院眼科行翼状胬肉切除手术的24例原发性翼状胬肉患者(男10例，女14例)，所有患者术前均由专业眼科医生进行检查，参照文献[3]，根据翼状胬肉组织的透明度(T1～T3级)和血管化程度(V1～V3级)将翼状胬肉分为静止期翼状胬肉(8例)和活动期翼状胬肉(16例)。正常结膜组的结膜组织取自于6例结膜松弛症患者的术中。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，已通过广东省人民医院伦理委员会批准(编号：2019-406H-01)，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织体外培养、干预及分组术中获取翼状胬肉头部组织和正常结膜组织，PBS反复冲洗，剪除上皮下结缔组织，将整块上皮组织铺于60 mm培养皿，等待30 min，待组织块贴牢后加入完全培养基(DEME/F12培养液，含100 U·mL-1双抗和体积分数10%澳洲胎牛血清)，培养第3天时随机选取8例活动期翼状胬肉组织使用含10 μmol·L-1MIA602的完全培养基培养。根据翼状胬肉类型和培养条件分为正常结膜组、静止期翼状胬肉组、活动期翼状胬肉组和MIA602干预组。各组培养皿均置于37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养，每天于镜下观察翼状胬肉上皮细胞和结膜上皮细胞的生长情况，并记录细胞从组织块边缘起的最远生长距离。培养第5天收集组织块及细胞进行后续实验。

1.2.2 免疫印迹实验检测相关蛋白的表达培养第5天收集组织块及细胞，冷PBS清洗，加入RIPA裂解液提取蛋白质，BCA法进行定量并配平各组蛋白浓度，振荡混匀，98 ℃蛋白变性8 min。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电泳、电转后，蛋白条带转至PVDF膜，室温封闭1 h，分别使用GHRH-R(11000)、p-ERK1/2(11000)、Caspase-3(12000)和内参GAPDH(11000)一抗孵育，4 ℃过夜。第2天，4 ℃二抗孵育2 h，使用ECL系统显色，所得条带采用ImageJ软件进行灰度定量，计算蛋白相对GAPDH的表达水平。

1.2.3 免疫荧光染色检测相关蛋白的表达培养第5天时取出培养皿，轻轻夹去组织块并吸除旧培养液，PBS清洗，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，体积分数0.2% Triton X-100穿透5 min，体积分数5%山羊血清封闭20～30 min，滴加一抗GHRH-R(11000)、p-ERK1/2(11000)、Caspase-3(12000)，4 ℃过夜。PBS浸洗后，滴加荧光二抗(1500)，常温下孵育1 h，DAPI染核，封闭，干燥，荧光显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 一般情况静止期翼状胬肉组织较薄，裂隙灯下可清晰见到体部覆盖的巩膜外层血管，轻度的血管化，向角膜侵袭进展缓慢；活动期翼状胬肉组织较厚，裂隙灯下难以观察到体部覆盖的巩膜血管，且血管化严重，可见充盈的大血管爬行，向角膜侵袭进展较快。正常结膜组、静止期翼状胬肉组和活动期翼状胬肉组患者间性别、年龄差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

表1 各组翼状胬肉分级标准及患者一般资料

2.2 各组上皮细胞的增殖情况组织贴壁培养第2天，可见柱状上皮样细胞从组织块边缘爬出，密集排列，并随着培养天数增加，逐渐向外生长移行。每天测量细胞至组织块边缘的最大距离，并进行比较。结果显示，培养第5天，各组间上皮细胞最大生长距离的差异具有统计学意义(P<0.05)；但正常结膜组和静止期翼状胬肉组间的差异无统计学意义(P>0.05)；与正常结膜组、静止期翼状胬肉组比较，活动期翼状胬肉组PECs最大生长距离显著增大，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1，表2)。

图1 光镜下培养第5天各组上皮细胞最大生长距离(箭头示最远生长处)

表2 各组上皮细胞最大生长距离的比较

2.3 各组上皮组织中GHRH-R、p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相对表达情况免疫印迹实验检测结果显示，正常结膜组、静止期翼状胬肉组和活动期翼状胬肉组上皮组织中GHRH-R、p-EKR1/2和Caspase-3蛋白相对表达量多组间比较，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。与正常结膜组和静止期翼状胬肉组比较，活动期翼状胬肉组上皮组织中GHRH-R、p-ERK1/2蛋白相对表达量均显著升高，Caspase-3蛋白相对表达量则明显减少(均为P<0.05)。静止期翼状胬肉组与正常结膜组相比，虽然GHRH-R蛋白相对表达量较高(P<0.05)，但是p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相对表达量两组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图2)。

图2 免疫印迹实验检测各组上皮组织中GHRH-R、Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表达情况 与正常结膜组相比，aP<0.05；与静止期翼状胬肉组相比，bP<0.05。

2.4 阻断GHRH-R后各组p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相对表达情况培养第5天镜下观察发现，MIA602干预组PECs的增殖和移行速度明显趋于停滞，而未干预的活动期翼状胬肉组PECs则表现为继续快速向外生长延伸(图3)。 取两组PECs做免疫荧光染色，结果显示，与活动期翼状胬肉组相比，MIA602干预组细胞内p-ERK1/2绿色荧光亮度减弱，阳性细胞数量显著减少，而Caspase-3红色荧光亮度增强，阳性细胞数量明显增加(图3)。免疫印迹实验结果同样显示，与活动期翼状胬肉组比较，MIA602干预组中GHRH-R和p-ERK1/2蛋白相对表达量明显减少，而Caspase-3蛋白相对表达量显著增加(均为P<0.05)(图4)。上述结果表明，阻断GHRH-R能够有效降低p-ERK1/2的表达并促进Caspase-3表达，从而抑制PECs的增殖和迁移。

图3 免疫荧光染色观察MIA602干预后Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表达情况

图4 免疫印迹实验检测活动期翼状胬肉组和MIA602干预组中GHRH-R、Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表达情况 与活动期翼状胬肉组相比，aP<0.05。

3 讨论

翼状胬肉的发生与进展被认为与环境变化密切相关，尤其是紫外线、干燥、粉尘等因素[4]。不利的环境因素会持续刺激眼表分泌各类炎症因子，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、肿瘤生长因子-β1和血管内皮生长因子等，持续的炎症反应破坏了角膜缘干细胞，导致结膜上皮细胞向角膜侵蚀，形成翼状胬肉[5-6]。关于翼状胬肉的严重程度，传统的文献多根据翼状胬肉体部的厚度或透明度来分期，虽然可以直观反映翼状胬肉的大小及纤维化程度，但是却很难反映翼状胬肉的侵袭性。因此，临床上结合血管化程度，将原发性翼状胬肉分为静止期和活动期，更充分地体现翼状胬肉的增殖和侵袭速度[3]。本研究结果显示，相较于静止期，典型的活动期翼状胬肉多表现为头部突起，颈部宽大，角膜侵蚀较深，表面血管明显充盈等。在组织培养中也显示，活动期翼状胬肉组中PECs的增殖和迁移速度显著快于静止期翼状胬肉组，而静止期翼状胬肉组中PECs的增殖和迁移速度则与正常结膜无明显差别。这说明早期治疗时将翼状胬肉控制在静止期是避免患者视力损害和手术治疗的重要方式。

炎症反应在翼状胬肉的发病机制中发挥着关键作用。有研究发现，在炎症环境下，PECs能够激发出类似干细胞的特性，并分泌MMPs和MMPs抑制剂，分解细胞外基质，促使细胞增殖和迁移。但是MMPs及其抑制剂很少表达于翼状胬肉成纤维细胞或正常结膜上皮细胞[7]。因此，寻找PECs接受炎症信号的媒介，抑制炎症反应对PECs的持续激活，是治疗翼状胬肉的重要途径。本课题组早期研究从14例翼状胬肉患者的翼状胬肉上皮组织中检测到高表达的GHRH-R蛋白[8]。GHRH-R被认为是调节细胞增殖和凋亡的重要受体，尤其是关于肿瘤细胞的研究[9]。为了进一步确认GHRH-R在翼状胬肉进展中的作用及机制，本研究将翼状胬肉分期后进行实验，结果显示，与正常结膜组、静止期翼状胬肉组比较，活动期翼状胬肉组中GHRH-R和p-ERK1/2蛋白表达水平均升高，Caspase-3蛋白表达水平降低。静止期翼状胬肉组GHRH-R蛋白表达虽然也有一定程度的增加，但p-ERK1/2和Caspase-3蛋白的表达与正常结膜组无明显差别。这提示活动期翼状胬肉GHRH-R蛋白显著高表达，促使PECs增殖，同时抑制其凋亡，从而使翼状胬肉具有更强的生长和侵袭能力。

GHRH-R蛋白在生物体内可以调控胰岛β细胞的存活[9]，以及促进心脏保护[10]和伤口愈合[11]，该作用与GHRH相关激酶的激活有关，包括MAPKs、ERK1/2和Caspase-3[12]。ERK1/2是MAPK通路的关键组成部分，ERK1/2磷酸化后进入细胞核，激活下游转录因子和细胞核激酶，调控基因进入复制周期，促使细胞增殖[13-14]。Caspase-3则是细胞杀伤机制中的重要组成部分，通过剪切DNA参与细胞凋亡的诱导[14-15]。为了确认GHRH-R是否通过介导ERK1/2和Caspase-3影响PECs，本研究使用GHRH-R拮抗剂MIA602干预活动期翼状胬肉，结果显示，GHRH-R蛋白被MIA602阻断后，p-ERK1/2的表达明显下降，而Caspase-3的表达则显著增加，PECs的增殖速度明显减缓，并且出现细胞凋亡。因此，阻断GHRH-R可有效地抑制ERK1/2活化和促进Caspase-3表达，从而抑制活动期翼状胬肉PECs的生存和增殖。

综上所述，本研究结果显示，GHRH-R在翼状胬肉的发生和进展过程中发挥着关键作用，尤其是在活动期翼状胬肉，其机制可能是GHRH-R通过激活ERK1/2和抑制Caspase-3表达促使PECs的生存和增殖，阻断GHRH-R可有效地调控PECs的增殖和凋亡，从而抑制翼状胬肉生长。本实验的结果可为临床翼状胬肉的早期预防和治疗提供新的研究方向和治疗靶点。

致谢：感谢香港中文大学彭智培教授和朱伟杰教授对本研究提供的针对性意见和修正。