腺苷A2A受体(A2AR)拮抗剂ZM241385对视网膜脱离动物模型视网膜光感受器细胞的保护作用△

高 莎 沈 玺

视网膜神经上皮层与色素上皮层分离是视网膜脱离(RD)患者视力丧失的主要原因。尽管常规手术治疗可以复位视网膜，但RD诱导的光感受器细胞凋亡可导致患者视功能恢复欠佳[1]。因此，研究RD病理损伤的过程，探索保护光感受器细胞的药物，对于RD患者视觉稳定具有重要意义。

腺苷A2A受体(A2AR)是神经网络中的关键分子。我们前期研究发现[2]，A2AR存在于小鼠视网膜Müller细胞和小胶质细胞中，A2AR拮抗剂ZM241385可抑制RD动物模型视网膜Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和白细胞介素-1表达，并可抑制小胶质细胞活化，降低视网膜氧化应激水平，减少光感受器细胞凋亡。然而，对于ZM241385在RD动物模型视网膜中介导的神经保护作用仍需进一步阐释。

Müller细胞参与RD动物模型视网膜神经胶质细胞增生、炎症级联反应和增殖反应[3]，它也是光感受器细胞凋亡的主要细胞毒素来源[4-5]。视网膜中谷氨酰胺合成酶(GS)由Müller细胞合成，可以分解谷氨酸从而减轻谷氨酸堆积产生的细胞毒性作用，防止视网膜神经细胞发生退行性病变[6]。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和肿瘤坏死因子(TNF)-α是重要的炎症细胞因子，在RD动物模型视网膜中的含量均显著增多[7-8]。本研究拟探讨ZM241385对RD动物模型视网膜光感受器细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组选取健康雄性SPF级C57BL/6J小鼠48只作为研究对象，鼠龄7～9周，体质量25～30 g，由上海交通大学医学院附属瑞金医院提供。所有动物实验均严格遵循美国视觉眼科研究学会对动物实验的要求和上海交通大学医学院对动物实验的规定。将实验小鼠随机分为对照+二甲基亚砜(DMSO)组、对照+ZM241385组、RD+DMSO组、RD+ZM241385组，每组12只，每只小鼠右眼用于实验。RD模型建立后，实验小鼠立即腹腔注射ZM241385(3 mg·kg-1，剂量不超过0.2 mL)或同体积DMSO，连续给药3 d。

1.1.2 实验试剂ZM241385(美国Selleck生物科技有限公司)，抗β-actin抗体、抗MCP-1抗体(美国CST公司)，抗TNF-α抗体、抗Cleaved caspase 3抗体、抗B细胞淋巴瘤抗体(Bcl)-2(美国Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 RD小鼠动物模型的制备参照文献[9]的方法，取实验小鼠经戊巴比妥钠(30 mg·kg-1，腹腔注射)麻醉，去氧肾上腺素(50 g·L-1)和托吡卡胺(5 g·L-1)散瞳。在手术显微镜下剪开角巩膜缘后颞侧球结膜。应用30G针沿角膜缘后2 mm处制备巩膜隧道，并穿刺角膜降低眼压。将连接Hamilton 10 μL注射器的33G针头通过巩膜隧道插入周边视网膜下腔，缓慢注入10 g·L-1透明质酸钠4 μL，使约60%的视网膜神经上皮层与下方色素上皮层分离，随后采用氧氟沙星眼膏涂眼。分析并排除视网膜下出血或未发生脱离的眼。

1.2.2 免疫荧光染色检测视网膜中Müller细胞GS的表达注药后3 d，通过腹腔注射过量20 g·L-1戊巴比妥钠每组处死3只小鼠，摘出眼球置入40 g·L-1多聚甲醛固定液(4 ℃，过夜)中，制备视杯，采用梯度浓度蔗糖溶液脱水，OCT包埋。常规制作视网膜组织冰冻切片，用PBS漂洗(3次，每次5 min)；然后使用体积分数0.1%的TritonX-10浸泡20 min，PBS漂洗(3次，每次5 min)；滴加山羊血清封闭液封闭30 min，PBS漂洗(3次，每次5 min)；滴加兔源GS抗体(1200)，于4 ℃孵育过夜，PBS漂洗(3次，每次10 min)；滴加Alexa-555标记的抗兔二抗室温避光孵育2 h，PBS漂洗(3次，每次5 min)；滴加含DAPI的封片剂封片后，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察和拍照。

1.2.3 Western blot检测视网膜MCP-1、TNF-α、Cleaved caspase 3和Bcl-2的表达注药后3 d，通过腹腔注射过量20 g·L-1戊巴比妥钠每组处死9只小鼠，摘出眼球，于冰上小心分离视网膜神经上皮层，立即置于液氮罐中保存。将液氮保存的视网膜样本称重后按16加入预冷的高强度RIPA裂解液，4 ℃下充分匀浆。静置1 h后，采用高速冷冻离心机离心(20 000 r·min-1，30 min)后吸出上清，采用BCA法对蛋白样品进行定量，100 g·L-1SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜，用50 g·L-1脱脂牛奶封闭膜(37.5 ℃，1 h)，根据相对分子质量截取目的蛋白MCP-1、TNF-α、Cleaved caspase 3、Bcl-2和β-actin条带，配制适当浓度的兔源一抗，将PVDF膜放入其中，4 ℃孵育过夜。之后，采用TBST溶液漂洗(3次，每次5 min)，羊抗兔二抗孵育(37.5 ℃，2 h)后TBST溶液再次漂洗(3次，每次5 min)，滴加化学发光液显色，以凝胶成像系统拍摄并用ImageJ软件分析各蛋白灰度值。采用β-actin为内参蛋白，计算各蛋白相对表达量(目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值)，实验独立重复3次。

1.3 统计学分析本研究数据应用GraphPad软件(Prism 8)进行分析，所有计量资料均以均数±标准差表示。采用t检验和单因素方差分析进行组间比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠视网膜Müller细胞GS的表达免疫荧光染色结果显示：RD+DMSO组小鼠视网膜Müller细胞GS荧光强度较对照+DMSO组显著降低，而RD+ZM241385组小鼠视网膜Müller细胞GS荧光强度较RD+DMSO组显著升高(图1)。这表明ZM241385可以促进RD小鼠视网膜Müller细胞GS的表达。

图1 免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜Müller细胞GS的表达 A:对照+DMSO组；B：对照+ZM241385组；C：RD+DMSO组；D：RD+ZM241385组。GCL为神经节细胞层，INL为内核层，ONL为外核层。

2.2 各组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达情况Western blot检测结果显示：对照+DMSO组、对照+ZM241385组、RD+DMSO组和RD+ZM241385组MCP-1相对表达量分别为0.30±0.02、0.31±0.04、0.70±0.03、0.32±0.02，TNF-α相对表达量分别为0.29±0.02、0.26±0.02、0.56±0.02、0.29±0.03。对照+DMSO组和对照+ZM241385组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达水平组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RD+DMSO组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达水平较对照+DMSO组均显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.001)，而RD+ZM241385组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达水平较RD+DMSO组均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图2)。这表明ZM241385可以抑制RD小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达。

图2 Western blot检测各组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白的表达

2.3 各组小鼠视网膜凋亡相关蛋白表达情况Western blot检测结果显示：对照+DMSO组、对照+ZM241385组、RD+DMSO组、RD+ZM241385组Cleaved caspase 3蛋白相对表达量分别为0.11±0.01、0.13±0.01、0.46±0.03、0.14±0.02，Bcl-2相对表达量分别为0.46±0.02、0.48±0.02、0.17±0.02、0.44±0.01。对照+DMSO组和对照+ZM241385组小鼠视网膜Cleaved caspase 3、Bcl-2蛋白表达水平组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与对照+DMSO组相比，RD+DMSO组小鼠视网膜Cleaved caspase 3蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著下降，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。而与RD+DMSO组相比，RD+ZM241385组小鼠视网膜Cleaved caspase 3蛋白表达水平显著下降，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图3)。这表明ZM241385可以抑制RD小鼠视网膜Cleaved caspase 3蛋白表达并可促进Bcl-2蛋白表达。

图3 Western blot检测各组小鼠视网膜Cleaved caspase 3、Bcl-2蛋白的表达

3 讨论

RD的主要病理学特征为视网膜神经上皮层和色素上皮层分离，分离后的神经上皮层丧失了与色素上皮层的物质交换和来自脉络膜的血供，继发胶质细胞活化、炎症等一系列反应，导致光感受器细胞外节崩解缩短和光感受器细胞凋亡[10]。

在RD病理生理改变中，Müller细胞参与神经胶质细胞增生以及炎症级联反应和增殖反应[3]，它也是光感受器细胞凋亡的主要细胞毒素来源[4-5]。视网膜中GS由Müller细胞合成，可以分解谷氨酸从而减轻谷氨酸堆积产生的细胞毒性，防止视网膜神经细胞发生退行性病变[6]。以往对RD动物模型研究发现，RD造模2 d后即可发现GS表达下降，7 d后下降到几乎检测不到的水平[11]。本研究也发现，RD小鼠造模3 d时Müller细胞GS表达显著下降，而应用A2AR拮抗剂ZM241385可以有效上调RD动物模型视网膜GS表达水平，GS分布自外核层贯穿整个神经视网膜。本研究结果提示，阻断A2AR可以提高RD动物模型视网膜中Müller细胞GS表达水平，减少视网膜谷氨酸堆积，预防视网膜功能障碍，在RD治疗中发挥积极作用。

MCP-1和TNF-α是重要的炎症细胞因子，常参与各种视网膜病变[12-14]。研究报道，MCP-1在RD患者玻璃体[15]及RD大鼠视网膜[7]中表达增加。近期研究发现，RD导致Müller细胞中MCP-1表达增加，并导致脱离视网膜中CD11b+巨噬细胞/小胶质细胞显著增多，而应用MCP-1抗体阻断或MCP-1基因缺陷小鼠可以有效抑制脱离视网膜巨噬细胞/小胶质细胞浸润和光感受器细胞凋亡[16]。研究证明，RD大鼠视网膜TNF-α表达显著增多[8]，经MSC-Exos处理后RD动物模型视网膜TNF-α表达降低，同时光感受器细胞凋亡减少。本研究发现，RD小鼠视网膜MCP-1、TNF-α表达均显著增加，而ZM241385干预后RD小鼠视网膜MCP-1、TNF-α的表达均显著降低。本研究结果表明，A2AR拮抗剂ZM241385可以抑制RD小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达。

A2AR在不同病理状况下的介导作用存在差异。在外周免疫细胞中激活A2AR具有抗炎作用[17-18]，而在中枢神经系统的慢性疾病中，阻断A2AR可以保护神经细胞[19]。最近，A2AR拮抗剂ZM241385干预已被证实可以减少胶质细胞的活化并降低促炎因子的表达，从而提高实验性青光眼的神经节细胞存活率[20]。此外，A2AR阻断也已被证实可降低具有缺血样损伤的大鼠脑星形胶质细胞活化[21]。我们前期研究发现[2]，A2AR存在于小鼠视网膜Müller细胞和小胶质细胞中，A2AR拮抗剂ZM241385可以抑制RD造模后Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和白细胞介素-1表达，抑制小胶质细胞活化及视网膜氧化应激，减少光感受器细胞凋亡。本研究我们发现，ZM241385可以上调RD动物模型小鼠视网膜Müller细胞GS表达水平，抑制视网膜MCP-1、TNF-蛋白表达，同时抑制凋亡执行蛋白Cleaved caspase 3表达，上调抗凋亡因子Bcl-2的表达。研究证实，ZM241385可以有效抑制RD造模后Müller细胞谷氨酸堆积细胞毒性，缓解视网膜神经炎症反应，进而减少光感受器细胞凋亡。因此，阻断A2AR的药物疗法可能对抑制RD诱导的光感受器细胞凋亡至关重要。不过，为更好评估A2AR调控在RD疾病治疗中的效果，A2AR拮抗剂的给药方式仍需改进。